Ever since I was a bookish person, my life has always been influenced by many books. In elementary school, when I read the autobiography of Hideki Yukawa, a renowned physicist and Nobel laureate, inspired to become a scientist in the future. Being particularly proficient in math during my junior and senior high school years, I entertained the idea of becoming a mathematician. However, I came across an article in the newspaper stating that most students, except for the exceptionally gifted, ended up as high school teachers. Doubting my own abilities in math, I abandoned the idea of pursuing a career as a mathematician and instead decided to become a medical doctor.

After graduating from medical school, I embarked on my journey as a physician and eventually specialized in chest medicine. I thoroughly enjoyed my life as a doctor, seeing and treating patients on a daily basis. However, amidst the hectic life of a clinician, while reading research papers, I began to feel a strong desire to engage in research myself. To pursue my interest in research, I decided to work as a research fellow at the famous Research Institute for Tuberculosis, specializing in pulmonary pathology, for two years. Unfortunately, during that time, my experience merely solidified the conviction that "I cannot grasp the true essence of diseases solely through immunohistochemistry and autopsy pathology in this setting." Frustrated by this realization, I ultimately concluded that to overcome this impasse, I needed to pursue graduate studies and engage in fundamental research. After obtaining my PhD, I joined the lab of Professor Ko Okumura, a renowned scientist known for his discovery of perforin and CD86, at Juntendo University Graduate School of Medicine in April 1995. Professor Okumura granted me to initiate my independent project focusing on the signaling pathway through the TNF receptor superfamily. Fortunately, just two months after joining the lab, I successfully identified a cDNA fragment of a novel member of the TRAF family, designated as TRAF5, and published a paper on it in 1996.

I made the decision in 2009 to shift our project's focus towards murine disease models. During the analysis of these disease models in mice, the knowledge and skills I acquired during the two years I spent at the Research Institute for Tuberculosis, where I learned about immunohistochemistry and the fundamentals of pathology, suddenly resurfaced. It was in that moment that I truly understood the essence of what Steve Jobs had said: "You can't connect the dots looking forward; you can only connect them looking backward." This realization highlights the significance of embracing each day and recognizing that nothing in life is truly wasted, as every experience has the potential to be valuable as long as we give our best in every moment.
In 2014, upon joining Toho University, I attained a fully independent position and took the lead in a team dedicated to cell death research, not focusing on the signal transduction pathways leading to cell death, but rather on biological responses initiated by dying cells.

はじめに

我々の体の中では絶えず多数の細胞が死に、新しい細胞に置換されていることが知られており、その細胞死の多くはアポトーシスと考えられている。発⽣過程において認められる細胞死はアポトーシスと考えられていたことから、遺伝⼦にプログラムされた細胞死（プログラム細胞死あるいは計画的細胞死）はアポトーシスと同義であると⻑らく考えられてきた。しかし、ある特定の遺伝⼦により制御された細胞死は、最近の研究からアポトーシス以外にも複数存在することが明らかにされた 1-5)。これを⾒ると Cell Death Disease 誌に掲載される細胞死の数は年を重ねるごとに増え続けており、細胞死の専⾨家であっても全てをフォローするのは不可能に近い。本特集は様々な制御された細胞死および死細胞貪⾷（エフェロサイトーシス）についての最先端の研究を紹介していただくことを⽬的として本特集を企画させていただいた。まず初めに私の細胞死研究の個⼈的な体験から話を始めたい。

アポトーシス研究からネクローシス研究へ

1972 年に組織の形態学的な観察からアポトーシスという細胞死が定義された。その後アポトーシス研究は、1980年代に線⾍を⽤いた遺伝学的な研究から⾶躍的な進歩を遂げた。1986年には Horvitz らが線⾍のアポトーシス実⾏因⼦ Ced-3(Cell death abnormal)を同定した。それに前後してアポトーシス細胞貪⾷に関与する遺伝⼦や、Ced-3 の活性制御因⼦が次々とクローニングされた。その後 Horvitz の弟⼦の Yuan のラボに留学していた三浦が哺乳類での最初のアポトーシスの実⾏因⼦（ICE、その後にカスパーゼ 1 と改名）の機能的な同定に成功したのが 1993 年であった。⼀⽅で⽶原・⻑⽥らは細胞にアポトーシスを誘導する細胞膜受容体として Fas を 1991 年に同定していたが、Fas からのシグナルがどの様な分⼦を介して、最終的にアポトーシスを誘導するかについての全貌の解明にはまだ数年を待たなくてはならなかった。

私が NF-_kB や TNF についての研究を始めた 1995 年当時は、ヒトやマウスの全ゲノムシークエンスは解読されておらず、マウスやヒトのタンパク質をコードする遺伝⼦が何万個あるかもわからず、ちょうど Expressed sequence tag (EST)データベースが作成されかけようとしていた時代であった。ある遺伝⼦の機能を抑制するための siRNA も開発されておらず、artifact を伴うことが⼗分考えられる dominant negative 体の遺伝⼦を過剰に発現させることで、その遺伝⼦の機能を阻害する実験が主流であった。もちろん Crispr/Cas9法もなく、⽐較的容易にノックアウトマウスやノックアウト細胞が作成できない時代であった。この様な状況にあっても yeast two hybrid 法, EST data ベースを⽤いたホモロジーリサーチ、タンパク質精製などの様々な⼿法をそれぞれの研究グループが駆使することで、アポトーシスに関与する新たなプロテアーゼ（後にカスパーゼと命名）や、細胞膜受容体からアポトーシス誘導に関与するアダプター分⼦などが次々とクローニングされていった。Topjournals には毎号のように新しい分⼦の同定が発表されるという時代であった。1995 年〜1997 年にかけて Dixit や Wallach らはそれぞれ独⽴して FADD (MORT1)、FLICE (MACH、現在の Caspase 8)、I-FLICE (CASH, 現在の cFLIP)を同定し、これらの研究は細胞死受容体からカスパーゼの活性化を繋いだという点でエポックメーキングな研究であった。また1996 年から 1997 年にかけて Wang らはタンパク質精製という地道なアプローチから、Cytochrome C, Caspase 9、Apaf-1 というアポトーシスの内因性経路の実⾏因⼦の同定に成功した。さらに 1998 年に⻑⽥らは DNA の断⽚化に関与する DNase（CAD）を同定した。このようにアポトーシス実⾏の⼤まかなフレームワークが 1990 年代の終わりには解明された。

⼀⽅でアポトーシス細胞の表⾯に発現するフォスファチジルセリン(PS)の認識やその表⾯への発現の分⼦メカニズムの研究については、⻑⽥らが世界の研究を先導した。2002 年と 2007 年に PS を認識する分⼦として MFG-E8 と Tim4 をそれぞれ同定し、さらに PS の⾮対称性分布に関与し、かつアポトーシスによりその活性が制御される酵素として2013 年と 2014 年に XkR8 と ATP11C をそれぞれ同定した。

それではネクローシスの研究はどうなっていたのだろうか？1998 年 にVandenabeele らは L929 細胞と呼ばれるマウス線維⾁腫に TNF により誘導されるネクローシス様細胞死は、カスパーゼインヒビターである zVAD により逆に促進されることを報告した。2000 年に Tschopp らは Jurkat 細胞を zVAD 存在下で Fas 抗体で刺激すると、カスパーゼ⾮依存性のネクローシス様細胞死が誘導され、さらにその細胞死は RIP1（RIPK1）と呼ばれるキナーゼのキナーゼ活性依存性であることを報告していた。しかしこの当時の多くの研究者は、カスパーゼ⾮依存性の細胞死が細胞死受容体からの刺激により誘導されるという現象については、あるかもしれないものの、あくまで特殊な細胞で⾒られる現象だろうと考えていた。この様な中でネクローシス研究にもブレークスルーをもたらしたのは、Ced-3/Caspase の研究を先導した Yuan らの研究であった。2005 年に Yuan らは zVAD 存在下で TNF 刺激することにより誘導されるネクローシス様細胞死を阻害する薬剤としてNecrostatin-1 を同定し、2008 年に Necrostatin-1 の標的が RIPK1 であることを明らかにした。これらの研究がきっかけとなり制御されたネクローシス（ネクロプトーシス）は、細胞死研究の中で中⼼的なテーマの⼀つに躍り出た。さらに 2009 年に Wang と Chan らによりそれぞれ独⽴して、RIPK3 が RIPK1 のネクロプトーシス誘導時に下流で働くキナーゼであることが同定された。さらに 2011 年には独⽴した 3 つのグループにより⻑い間不明であった Caspase 8 KO や Fadd KO マウスの胎⽣致死の表現型が、Ripk1 や Ripk3 のノックアウト（KO）マウスと交配することで、レスキューされることが明らかとなった。これらの研究は外因性アポトーシス経路が阻害されると、ネクロプトーシス経路が亢進し胎⽣致死となることを初めて⽰した研究であった。その後 2012 年に Wang らによりネクロプトーシス実⾏時に細胞膜のポア形成に関与する実⾏分⼦として MLKL が同定され、ネクロプトーシス誘導に関与する中⼼的なプレイヤーは出揃った。

以上が 1995 年〜2010 年代初頭にかけての私の個⼈的な細胞死研究体験である。この他にも多くの優れた研究があるが、紙⾯の都合で引⽤できないことをお許しいただきたい。細胞死研究がもっとも輝いていた時代に、同じ時代の空気を吸いながら（⽇本にいて少し遅れた空気だったかもしれないが）、細胞死研究を継続してこられたことは⾮常に幸運だったと思っている。

私のコメンタリーに興味を持たれた⽅は是⾮原著論⽂を読んでいただき、それぞれの研究の素晴らしさを堪能していただきたい。

This post reflects on the long and winding road that led to the discovery of the oxidative stress-inducible gene, interleukin 11, as a marker for cancerassociated fibroblasts.

Hiroyasu Nakano and Takashi Nishina

It has been over ten years since we started a project to visualize oxidative stress in vivo with a murine model. To achieve this goal, we first hypothesized that we needed to identify the gene (s) induced by oxidative stress. Once we identified the responsible gene(s), we constructed vectors that harboured a fluorescent protein gene, such as enhanced green fluorescence protein (Egfp), placed under the control of the promoter of oxidative stress-induced genes. The promoter of those genes could be then used to control EGFP expression to visualize oxidative stress. Based on this strategy, we first attempted to identify oxidative stress-inducible genes by stimulating murine embryonic fibroblasts with hydrogen peroxide in a microarray analysis. The expression levels of over 200 genes rapidly increased more than 4-fold. We first selected 10 genes from the top of the list of upregulated genes, which showed more than 30-fold increases in expression. Considering that our final goal was to visualize oxidative stress in vivo, genes that were upregulated by oxidative stress in vivo were considered candidate genes.

We previously reported that oxidative stress was tightly associated with cell death1; therefore, we surmised that a murine acute liver injury model might be suitable for testing whether these candidate genes were upregulated. Injecting mice with anti-Fas antibody was known to induce acute liver injury2. To our surprise, after injecting the anti-Fas antibody into mice, and analysing the livers, we found that the ten candidate genes did not show any increase in expression. Thus, we needed to examine 200 other genes that were upregulated more than 4-fold after oxidative stress. For this analysis, we needed to come up with an efficient method for selecting candidate gene(s) for vector construction. After struggling on this project for several months, a candidate gene emerged from another project in my lab, during an analysis of livers from Cflarflox/flox;Mx1- Cre mice. By using tissue specific Cflar-deficient mice3, we investigated a role of anti-apoptotic protein, cellular FLICE-inhibitory protein that is encoded by Cflar gene. The interferon (IFN)-inducible Mx1-Cre/loxP system was a prototype of the inducible Cre recombinase system, where a gene flanked by two loxP sites could be inactivated. We injected Cflarflox/flox;Mx1-Cre mice with polyinosinic:polycytidylic acid (poly I:C) that induces the production of IFNα/β by Kupffer cells. This procedure resulted in the expression of Cre recombinase in hepatocytes. We found that a Cre-dependent deletion of the Cflar gene in hepatocytes induced fulminant hepatitis4.

A microarray analysis revealed that, following the poly I:C injection, the most upregulated gene in the livers of Cflarflox/flox;Mx1-Cre mice was interleukin 11 (Il11), which was unfamiliar to us at that time. No one in the lab, including me, had paid attention to IL-11 before. According to my lab notes, on the night of February 28, 2009, I happened to find that Il11 was also on the list of upregulated genes in fibroblasts in response to oxidative stress! This indicated that IL-11 might be a potential candidate for visualizing oxidative stress in vivo. After performing many experiments to verify that IL-11 was indeed induced by oxidative stress in vitro and in vivo, we finally decided to generate Il11- Egfp reporter mice.

To generate Il11-Egfp reporter mice, we used a knock-in strategy to insert the Egfp gene just downstream of the ATG initiation site of the Il11 gene in a bacterial artificial chromosome (BAC). We initiated the generation of Il11- Egfp BAC transgenic mice in collaboration with Professor Otsuka at Tokai University, and Dr. Tada at Juntendo University, in 2010. We assumed that it would take several months to generate Il11-Egfp BAC transgenic mice. A talented scientist, Takashi Nishina, the first author of the present paper5, had recently joined our lab as a postdoctoral fellow in April, 2010. Before working on Il11-Egfp reporter mice, we investigated the role of IL-11 with an acetaminophen (APAP)-induced liver injury model. That study took almost two years to complete6. Then, Takashi concentrated his efforts on analysing Il11- Egfp reporter mice. We first examined whether Il11-Egfp mice could be used to monitor IL-11-producing cells in an APAP-induced liver injury model. However, we could not detect any EGFP signals in the liver. Those results were 3 disappointing, but Takashi did not give up and continued focusing on Il11- Egfp reporter mice.

Around that same time, an Australian group published a seminal paper on IL- 11. They reported that IL-11 expression was elevated in gastric and colorectal cancer (CRC) in human patients and in several murine models7. Moreover, they also showed that a blockade of IL-11 signalling, in IL-11 receptor knockout mice or with an IL-11 antagonist, resulted in a dramatic reduction in CRC development7. Given that oxidative stress is tightly associated with the development of various cancers8, and that IL-11 was induced by oxidative stress6, we hypothesized that IL-11 might be the missing link between oxidative stress and tumorigenesis. Thus, Takashi induced colitis in mice with dextran sodium sulphate (DSS) to visualize IL-11+ fibroblasts in vivo. Following DSS treatment, we successfully detected IL-11+ (EGFP+) cells in mouse colons, but the percentage of IL-11+ cells was very low. Nevertheless, Takashi isolated IL- 11+ cells from those mice and characterized their gene expression profiles in a microarray analysis. Most IL-11+ cells appeared to express stromal cell markers, such as Thy1, podoplanin, and Sca1; thus, they were considered to be stromal fibroblasts.

In April 2014, our group moved to Toho University, where we continued and expanded our work on IL-11. We investigated the role of IL-11 further by generating Il11-/- mice and anti-IL-11 antibody9. We could visualize IL-11+ cells in tumour tissues in the colons of mice treated with azoxymethane/DSS and in the progeny of ApcMin/+ mice crossed with Il11-Egfp mice. Of note, IL- 11+ fibroblasts were located adjacent to tumour cells (Figure 1).

Figure 1. IL-11+ cells are located adjacent to tumor cells. Colon tumor sections from ApcMin/+;Il11-Egfp mice were stained with anti-GFP (IL-11+ cells, green), anti-E-cadherin (tumor cells, white), anti-CD31 (endothelial cells, red), and DAPI (nuclei).

We combined these results with a meta-analysis of human cancer databases in an article published in April, 20215. However, that was not the end of the IL-11 story. Our present study revealed a correlation between IL-11+ fibroblasts and the development of CRC. Therefore, our next goal is to show directly that IL- 11+ fibroblasts contribute to the development of CRC, with another approach. For that purpose, we conceived a strategy for depleting IL-11+ fibroblasts after the development of CRC. If that strategy works well, we can conclude that IL- 11+ fibroblasts are indeed cancer-promoting fibroblasts, and they might serve as new targets for treating CRC.

References

(BEHIND THE PAPER; April 16, 2021. https://cancercommunity.nature.com/posts/interleukin-11-expressing-fibroblasts-have-aunique- gene-signature-correlated-with-poor-prognosis-of-colorectal-cancer)

ある本について書評を書くという⾏為は、ある場合には「その本を通して⾃分⾃⾝を語ることだ」とどこかで読んだ気もするが、もしかしたら私の勘違いかもしれない。⽯坂公成博⼠は免疫学の歴史に残る IgE を世界で初めて発⾒した研究者であり、⽶国で⻑らく研究を継続され、数多くの⽇本⼈研究者を育成（多⽥富雄教授、岸本忠三教授、⾼津聖志教授など）された免疫学の巨⼈の 1 ⼈である。この本は公成・照⼦博⼠夫妻が⽶国に渡りその後どのように研究⽣活を送り、学⽣やポスドクを教育してきたか、また⽶国での研究⽣活を終えられたあとで⽇本に帰国し、その後夫妻でどのような⽣活を送られたかを丹念につずった本である。私はこの本を読んだ時に先⽣の研究者の育成⽅法などに共感し、お⼿紙をお出ししたところ、予想外にも先⽣からお返事をいただいたことを今でも鮮明に覚えている。残念ながらいただいたお⼿紙は、私がラボを移る時に紛失してしまったことが悔やまれる。

先⽣がこのご本を執筆された時以上に、多くの研究分野で研究は個⼈の研究というよりも⼤きなグループで⾏うスタイルの研究にシフトしており、個⼈のアイデアが論⽂の質（少なくとも掲載される雑誌の質）を決める時代ではなくなって来ている。また研究者のポストの減少により、最近の⽇本では基礎研究分野に進もうとする若者がますます少なくなってきている。このような社会的に困難な状況で、かつ研究費の特定の分野への集中が叫ばれる中で、我々のようなシニアの研究者は少しでも多くかつ質の⾼い論⽂を出し、⼤きな研究費を獲得することが最⼤のミッションとなっている。公成博⼠の「⼤学院時代に最も重要なことは、インパクトの⾼い雑誌に論⽂を出すことではなく、将来的に独り⽴ちできる研究者となるための考え⽅を⾝につけさせることだ」という⾔葉は、我々シニア研究者にとってわかっていても、⾮常に思い⾔葉である。

最後に公茂博⼠は照⼦夫⼈が難病に倒られたために、夫⼈の故郷である⼭形に帰り夫⼈の看病をしながら 2018 年にご逝去されたことを付け加えておきたい。私の⼤学院時代及び助教〜准教授時代のメンターのお 2 ⼈（奥村康教授、⿑藤隆教授）は多⽥富雄先⽣の弟⼦であり、私は多⽥先⽣の孫弟⼦にあたる。公成博⼠と私の研究内容は全く異なるが、免疫学の⼈脈としては繋がっており、公成博⼠がご存命中にお会いする機会がなかったことが悔やまれる。ご冥福を祈りたい。

1) はじめに

そう⾔えば学⽣時代から順天堂⼤学の助教として働きだした頃まで、引退したら晴耕⾬読の⽣活をして⼩説を書くのが夢だと周囲の⼈たちに時々⾔っていたような気がする。そんな発⾔の背景には、ある時期に集中して特定の⼩説家の本を読んできたという習慣があった。本来⼩説を読むことを⼤事な趣味の１つとしていたこともあり、⼤学院に⼊学して基礎研究の優れた論⽂を読んでから、「優れた論⽂は⼩説を読むよりも⾯⽩いし、かつ論⽂を書くということは１つの物語を作ることだ」と考えるようになっていた。また最近ではラボメンバーにはこの事を積極的に伝えるようにしている。優れた論⽂を読むことが、優れた⼩説を読むことよりも⾯⽩いと感じるのは、私だけではないと思う。

2) ⾯⽩い論⽂とは

それではどのような論⽂が⼩説より⾯⽩いのであろうか？40 年ほど前に團伊玖磨⽒の「パイプの煙」というエッセイ集を読んでいた時のことを思い出した。そのエッセイ集の中に「釣りをしている⼈」に寄ってくる⼈には2 種類の⼈間がいるという話が出てくる。１つは「釣りそのもの」に興味のある⼈であり、このタイプの⼈は「何が釣れますか」と聞く。⼀⽅で「釣りをしている⼈」に興味のある⼈は、「釣れますか」と聞くらしい。このようなことはサイエンスにも当てはまるかもしれない。サイエンスが好きな⼈たち（少なくともサイエンスに興味を持っている学⽣）には２つのタイプがあるような気がしている、１つはサイエンスそのもの（つまり研究や研究すること）が好きな⼈であり、もう1 つはサイエンスをしている研究者に興味がある⼈である。私が今回なぜDavid G. Schatz による⼀連の論⽂(1-3)とそれについてのエッセイ(4)を紹介しようとするのかというと、これらの論⽂が遺伝⼦再構成に関与するRecombination Activating Gene (RAG)1 とRAG2 と命名した遺伝⼦を同定したという歴史的な発⾒ということだけではなく、この発⾒がPhD を取得する前の2 ⼈の⼤学院⽣によって成し遂げられたという、誰が聞いても興味をそそられる話であるということが⼤きな理由である。

またこのクローニングのエピソードの中には我々がラボで直⾯する様々な問題や、研究の醍醐味、あるいは本来のメンターと指導される⼤学院⽣との理想的な関係を読み取 ることができる。周囲のうまくいかないだろうというアドバイスにも関わらず無謀とも思えるプロジェクトをスタートさせた勇気や、周囲のポスドクの冷ややかな視線にもかかわ らず、楽観的にかつユーモアを持って研究を黙々と継続して⾏ったSchatz ともう1 ⼈の⼥性の⼤学院⽣（Marjorie A. Oettinger）の精神⼒の強さ、それと彼らの研究をサポートした メンターのDavid Baltimore 博⼠との理想的な関係があったと思われる[Schatz のエッセイ(4)からは、メンターのBaltimore 博⼠がどの程度彼らの研究をサポートしていたかを読み取ることはできないが、少なくともこのリスキーなプロジェクトを中⽌させなかったこと、おそらく彼らの要求に応じて研究に必要な様々な試薬（ベクター、特殊な⼤腸菌や細胞など）を他の研究者から⼊⼿してくれていたことが推測される]。また2 ⼈がPhD を取得すると同時に他の⼤学で独⽴した研究者としてのポストを得て（おそらくいくら⽇本で優秀な⼤学院⽣でも、博⼠課程を修了してすぐに独⽴したポストにつくということはほぼ可能性がないと思われる）、現在も2 ⼈はそれぞれYale ⼤学とHarvard ⼤学で現役の教授として、RAG 遺伝⼦の研究を継続している。

本エッセイでは、まずRAG1 とRAG2 遺伝⼦のクローニングのあらましを紹介し、このエピソードから私が何を考え、我々のようなメンターが将来独⽴しようとする研究者をどのように教育していけばいいのかについて述べていきたい。

3) RAG1 の遺伝⼦クローニング

ハーバード⼤学医学部の学⽣であったSchatz が、Massachusetts Institute of Technology(MIT)のWhitehead Institute for Biomedical Research のBaltimore 博⼠の研究室でPhD 取 得のための研究を開始したのは1985 年であった（ちなみに私が⼤学の医学部を卒業したのは1984 年であり、1984-1985 年の2 年間は周囲の同級⽣と同じで、いちじるしく効率の悪い国⽴⼤学医学部の付属病院で臨床研修を⾏なっていた）。1970 年代後半にはすでに利根川進博⼠が抗体遺伝⼦で遺伝⼦再構成が起こることを証明しており、その遺伝⼦再構成を担う酵素を同定しようと世界中の研究グループがしのぎを削っていた時期であった。遺伝⼦再構成という複雑なステップを担う酵素は、当然のごとく単⼀の酵素により担われていると考えにくく、タンパク質の精製を指標とした酵素同定の試みや、サブトラクション法でリンパ球特異的に発現する遺伝⼦を同定する⼿法などが⾏われていたものの遺伝⼦の同定はうまく⾏っていなかった。Schatz はこのような状況の中でBaltimore 研究室でV(D)Jrecombination [V(D)J 遺伝⼦再構成]に関与する遺伝⼦（後にRAG1 およびRAG2 と命名）を同定するという無謀なプロジェクトをたった⼀⼈で開始することになった。

彼にとって幸運だったのは、まず①研究室の別の⼤学院⽣がちょうどその前年に、Vk-Jk遺伝⼦の中に抗⽣物質耐性遺伝⼦を逆向きに挿⼊した⼈⼯的な遺伝⼦断⽚を、遺伝⼦再構成の起こっている細胞に導⼊すると、遺伝⼦再構成に伴い抗⽣物質耐性遺伝⼦が順向きになり、抗⽣物質の耐性を獲得するというアッセイ系を確⽴していたことであった (5)（図1）。 2 番⽬の幸運は、②ポスドクの⼀⼈が、ラボミーテングで抗⽣物質耐性遺伝⼦を逆向きに⼊れた発現ベクターを導⼊した細胞を⽤いれば、V(D)J 遺伝⼦再構成に伴い抗⽣物質耐性が出現するので、このことを指標にしてV(D)J 遺伝⼦再構成に関与する遺伝⼦ のスクリーニングができるのではないかというアイデアを出したことであった。そこで彼はB 細胞由来のゲノムDNA を遺伝⼦再構成の起こっていない線維芽細胞に導⼊することにより、同定するという戦略を取ることにした。後にわかることだが、3 番⽬の幸運は③彼が外来遺伝⼦の導⼊⽅法としてcDNA ライブラリーをtransfection する⼿法をとったのではなく、ゲノムDNA のtransfection を⽤いたことであった。ここまでで少なくとも3 つの幸運が重なったことになる。

4) ゲノムDNA transfection によるV(D)J 遺伝⼦再構成活性を持つ遺伝⼦座の同定

線維芽細胞でV(D)J 遺伝⼦再構成を起こさせるためには、当然V(D)J 遺伝⼦再構成が起こっているリンパ球で発現している１個あるいは2 個以上の遺伝⼦が導⼊されることが必要だと容易に想像がつく。ここで重要なのは、１個なのか、２個以上なのかであり、仮に1個であるならば通常⾏われるcDNA ライブラリーのtransfection で遺伝⼦を取ることが可能である。しかし仮に２個以上の遺伝⼦が必要であるならば、cDNA ライブラリーのtransfection による相補的スクリーニングで遺伝⼦を同定することはほとんど不可能に近い。なぜなら少ない頻度でしか存在しないであろうV(D)J 遺伝⼦再構成に関与する２個以上の遺伝⼦が、偶然にも１個の細胞に導⼊される確率は、天⽂学的に低い数字だからである。V(D)J 遺伝⼦再構成という複雑な現象を考えると、当然のごとく単⼀の遺伝⼦だけでこの現象を誘導できるなどと考えるのは妄想に過ぎないと思われていた。このような状況の中で、メンターの保守的なアドバイスを無視して、David G. Schatz は遺伝⼦導⼊による相補的スクリーニングをスタートさせることになった。今から考えると最も幸運だったのは、前述したように彼がcDNA ライブラリーのtransfection ではなく、その当時隣のラボ（オンコジーンの研究で有名なRobert A. Weinberg 博⼠の研究室）でよく⾏われていたゲノムDNA(〜100 kb サイズのDNA)のtransfection 法を⽤いたことであった。もしSchatz がcDNA ライブラリーのtransfection を⾏なっていたとするならば、決して成功していなかったであろう。なぜなら結果的にはV(D)J 遺伝⼦再構成を誘導するには１個の遺伝⼦では不⼗分で、RAG1 とRAG2 と命名された２個の遺伝⼦が必要であり、cDNA ライブラリーのtransfection で同⼀の細胞にこの2 つの遺伝⼦が⼊る可能性は限りなく低かったからである。このように幸運もあってSchatz はゲノムDNA のtransfection によりV(D)J 遺伝⼦再構成の活性を有する1 つの遺伝⼦（正確に⾔えば1 つのゲノムの遺伝⼦断⽚あるいは遺伝⼦座）を同定することができた (1)。

5)RAG1 遺伝⼦の同定

途中からMarjorie A. Oettinger という⼤学院⽣がこのプロジェクトに参加し、彼⼥の存在があって初めてRAG1 遺伝⼦の同定と、それにひき続くRAG2 遺伝⼦の同定という歴史的な発⾒がなされることになる。この歴史的な発⾒がポスドクでもない、2 ⼈の⼤学院⽣により成し遂げられたわけである。2 ⼈は常に楽観的でありかつユーモアを持ちつつ、様々なクローニング⼿法を試みていった。⼀⽅でその当時のラボの周囲の⼈たちの雰囲気は、決して2 ⼈の研究に対して好意的なものではなかった。その当時の周囲の雰囲気を隣のラボのポスドクの発⾔「すると君が例のアーチファクトの論⽂をCell に発表した⼈なんだ」が端的に表しており、多くの⼈たちは「彼らはありもしない架空の遺伝⼦を追いかけている」と考えていた。

もっとも困難だった点はゲノムの中から、transfection により導⼊されかつV(D)J遺伝⼦再構成に関与するゲノム断⽚を⾒つけ出すことであった。様々な⽅法が試された後に、transfection に使⽤するゲノム DNA にオリゴヌクレオチドタグ（⼈⼯的に合成した数⼗塩基からなる⽬印）を付加し、さらに遺伝⼦組換え活性の⾮常に低い特殊な⼤腸菌をホストとして⽤いることで、V(D)J 遺伝⼦再構成活性を有する導⼊されたゲノム断⽚の⼀部をクローニングすることができた（図2）。そこからgenomic walk をする（当時は現在のようにヒトゲノムは解読されておらず、どの染⾊体のどの場所にどのような遺伝⼦が存在するかもわかっていなかった）ことにより、最終的には遺伝⼦を同定し、塩基配列を決定することに成功した（図2）。この遺伝⼦はリンパ球やV(D)J 遺伝⼦再構成の活性の⾼いtransfectants でmRNA の発現が⾼いことも確認され、Recombination Activating Gene (RAG1)と命名された (2)。

6) RAG2 遺伝⼦クローニング

RAG1 遺伝⼦の同定だけでは話は終わらなかった。RAG1 遺伝⼦を発現させるだけでは、⾮常に弱いV(D)J 遺伝⼦再構成活性しか誘導できないことが判明し、2 ⼈は再び混迷へと突き落とされた。その後様々な可能性が検討された結果、驚いたことにRAG1 遺伝⼦の近傍（数キロベース離れた場所）に第2 の転写ユニットが存在していることが明らかになった（図3）。この遺伝⼦をRAG1 と同時に発現させることで、V(D)J 遺伝⼦再構成活性が⾮常に強く誘導されたことからRAG2 と命名され、遺伝⼦再構成にはRAG1 とRAG2 の２つの遺伝⼦は必要であることが初めて明らかとなった (3)。２⼈はその後PhD を取得してMIT を去り、かつ医者になることをやめてそれぞれ独⽴した研究室を持つことになった。

7) RAG1 とRAG2 遺伝⼦の進化

何故RAG1 とRAG2 遺伝⼦が⾮常に近接してゲノム上に存在してるのであろうか？これは単に天⽂学的な偶然が重なっただけなのであろうか？不思議なことにRAG1 とRAG2 遺伝⼦の中でタンパク質をコードする領域は、単⼀のエクソンから構成されていた。マウスRAG1 およびRAG2 タンパク質がそれぞれ1008 個および527 個のアミノ酸から構成されていることを考えると（図3）、このような⽐較的⼤きなタンパク質が単⼀のエクソンから構成されるのは珍しいことだと思われる。その後の研究で驚くべくことが判明した。２つの遺伝⼦は、ヤツメウナギなどの無顎類（Jawless vertebrates）には存在せず、顎を持つ脊椎動物（Jawed vertebrates）には存在することから、進化の過程で外部から⼊ってきたトランスポゾン由来の遺伝⼦であると考えられた。当初はRAG1 とRAG2 遺伝⼦の両者がトランスポゾン由来の外来性の遺伝⼦と考えられていたが、最新の研究から、宿主にもともと存在していたRAG2 様遺伝⼦の近傍にトランスポゾン由来のRAG1 様遺伝⼦が⾶び込み、両⽅の遺伝⼦が進化の過程でそのまま保持されたと考えられている (6)。また現在ではナメクジウオなどの頭索動物（Cephalochordates）やウニなどの棘⽪動物（Echinoderms）にもRAG1 様遺伝⼦とRAG2 様遺伝⼦が存在することが明らかにされている。この2 つの遺伝⼦により、我々の細胞は遺伝⼦再構成を起こし、膨⼤な数の抗体遺伝⼦やT 細胞受容体遺伝⼦を準備することができるようになったとすると、我々は何と巧妙に進化してきたのだろうと想をめぐらさずにはいられない。

8) このエピソードから我々は何を学べるか？

RAG1 とRAG2 遺伝⼦のクローニングは単に幸運が重なっただけだろうか？研究のキーワードとしてよく出てくる⾔葉に、Serendipity (セレンデイピテイ)という⾔葉がある。この⾔葉の定義は、「⽬的のものをみつけようとしていて、偶然にも⾒つけようとしていたもの以上に重要なものを発⾒する事。あるいは⾒つけようとしていたものが、まったく別の⽅法でみつかる事。」というようなものである。David G. Schatz らの遺伝⼦クローニングのハイライトはやはり、最初に同定したRAG1 遺伝⼦の数キロベース離れたところに、V(D)J遺伝⼦再構成活性を発揮するために必要なもう⼀つの遺伝⼦（RAG2）が存在していたことであることは間違いない。普通ある特定の酵素活性を発揮するのに必要な2 個の遺伝⼦が、ゲノム上の近傍に存在する確率は、遺伝⼦重複などによって遺伝⼦数が増える場合などを 除くと⾮常に低いはずである。また、ゲノムDNA のtransfection を⽤いなければ、RAG1とRAG2 遺伝⼦の同定はうまくいかなかったであろう。しかしこのようなことを考慮しても、彼らの仕事が単なる幸運の積み重ねの結果であるとは私は考えない。Serendipity についての著書のあるMorton A. Meyers は「Serendipity は、予想と反する結果が出た時にその結果をバイアスをかけずに⾒る洞察⼒と、予想外の結果の価値を⾒抜く能⼒が必要である。」と述べている (7)。2 ⼈のエピソードは⾃分たちの実験結果を信じ（私は常々「⾃分のデータを⾃分で信⽤できないのであれば、他⼈に⾃分のデータを信⽤させることは絶対にできない」と思っている）、常に楽観的に振る舞い、かつ周囲のnegative な意⾒や雰囲気をものともせず（positive な意味での鈍感⼒）、果敢に挑戦することの重要性を物語っている。

またこのエピソードは、優秀な⼤学院⽣あるいはポスドクを指導する場合には、いい研究テーマを与え、その後は⾃分の好きに研究をやらせ、アドバイスを求められたときに適切なアドバイスをすることがメンターとしての仕事であるということを⽰していると思う。往々にして⽇本の研究室（外国でもそのような研究室は多数あると思うが）では⼤きなテーマを複数の⼤学院⽣、ポスドクにやらせて⼤きな論⽂を執筆するというスタイルが存在する。確かにそのようなスタイルの⽅が効率的に論⽂を量産できるかもしれない。しかし、将来的に⾃⽴できる研究者を育成するには、みんなが同じ⽅向を向いているとい う⼀⾒効率的なラボ運営をするのではなく、極論すれば研究テーマだけを与えて好き勝⼿に実験をさせるのが、最も⾃⽴性がありかつ独⽴性を有する研究者を育成する⽅法ではないかと思えてくる。

9) ⾃分の研究⽣活を反省すると

それでは⾃分のこれまでの研究⽣活を考えてみて、何が良くて何が悪かったのであろうか。私は医学部を卒業し、その後５年間臨床医として働き、２年間病理を勉強するために研究所に勤務し、その後に分⼦⽣物学を学ぶために⼤学院に⼊学した。⼤学院時代の４年間は教授のメインプロジェクトとは異なった仕事をやっていたこともあり、⾃分でもやっている研究がそれほど重要な研究だという実感もなく、かつ満⾜できる論⽂や研究成果を得ることなく過ごした。今から思うとこの４年間は、⾃分の⼈⽣の中で最⼤の危機だったと思う。努⼒が報われる臨床医としての⽇々と決別して、基礎研究を始めて⾒たところ、⽇々 の努⼒にも関わらず実験は遅々として進まず、⾃分の実験の不備を徹底的に批判されるという、これまで私の⼈⽣の中で経験したことのない⽇々であった。毎週⾏われた個別の討論では、陽性コントロールと陰性コントロールが必要なことを徹底的に教え込まれた。またどれだけ考えても、⾃分の仮説が間違っていれば陽性の結果が得られないことを⾝にしみて感じることができた。この時期のトレーニングは医学部卒で、基礎的なトレーニングを受けていない⾃分にとっては、修⼠課程でのトレーニングをしていたようなものだったのかもしれない。しかし、その中でも数少ない実験の喜びを経験できたことが、その後の⾃分の研究⽣活に繋がっていると思う。

その後私が助教として赴任した当時の順天堂⼤学医学部免疫学教室は、国内留学⽣、⼤学院⽣、スタッフなどが⼊り混じっており総勢で40〜50 ⼈ほどの⼤規模なラボであった。⼈数の割には実験スペースは⾮常に狭いラボであり、ラボの雰囲気はカオス的な状況であった。赴任した当時はとんでもない研究室に来てしまったと後悔する毎⽇であったが、今から思うと奥村研のスタイルは、早くからメンターに頼らずに独⽴した研究者としての⾃覚を持つという意味では、私にとっては良かったのかもしれない。私がこれまで⼤学院⽣やポスドクを指導してきて反省しなくてはならない点は数多い。例えば、実験をな るべく早く進めるために、本⼈の⾃主性を無視して無理やりある⽅向で実験をやらせた場合が多々あり、このような場合には、ある程度実験は進むかもしれないものの、予想外の発⾒に遭遇する可能性はほぼゼロであり、結局のところ予想した以上の実験結果は得られなかった。また指導した⼤学院⽣や博⼠研究員を⾃⽴した研究者として育成することができたかについては、甚だ疑問が残る。如何に⾃主性を持って実験をやらせるか、その中で予想した結果と異なる結果が出た場合に、その実験結果を何のバイアスもかけずに素直に解釈して、次のステップにいけるかが最も研究者にとって肝⼼な点だと思っている。

10) ⼤学院時代に何を学ぶのか

それでは研究者として独り⽴ちできるだけの考え⽅をいつ⾝につけることができるのであろうか？これを⾝につけられるとしたら修⼠課程の時期、あるいは博⼠課程でしかあり得ない。しかし、現在の少なくとも医学部の博⼠課程の場合には、この研究者の考え⽅を⾝につけるというような本来の⽬的よりも、とりあえず何でもいいから論⽂を⼀つ筆頭著者で執筆して博⼠号を取得したいという⼤学院⽣が多い。ノーベル医学賞を受賞したG タンパク質共役受容体の研究で有名なRobert J. Lefkowitz 博⼠は、コーベルメダル賞を受賞した時の講演で、医者になってからNational Institute of Health で２年間初めて研究に従事した時のことを以下のように述べている (8)。「それまで医学部の学⽣時代から、実験というものを避けてきた私は、基礎的な実験の知識も経験もなく、実験は失敗の連続であり遅々 として進まなかった。そのような状況で私は2 ⼈の優れたメンターに巡り合った。⼀⼈のメンターは、私のことを⿎舞してやる気を出させてくれ、⼀⽅でもう⼀⼈のメンターは私の実験に適切なコントロール実験のないことを容赦無く指摘し、結論を導き出すことのできない実験だと徹底的に批判し、常に私を奈落の底につき落とした。」彼のそれまでのプライド（彼は成績優秀で⾶び級をしていた）は⽊っ端微塵に打ち砕かれたが、２年間の研究⽣活は、彼の⼈⽣を⼤きく変えることになった。その後のMassachusetts General Hospitalでのクリニカルフェローとしてのトレーニング期間に、彼は「実験結果⽋乏症」（このような病気はないと思う）に陥り、本来「クリニカルフェローは実験に従事してはいけない」と⾔う内規を破ってまで実験を⾏い、その後⽣涯を研究に捧げることになった。多⽥富雄先⽣（私のメンターの奥村康教授も斎藤隆教授も多⽥先⽣の弟⼦であり、私は孫弟⼦に当たる）の恩師である⽯坂公成博⼠が⼤学院時代の教育で最も重要なことは、「インパクトの髙い雑誌に論⽂を書くことではありません。最も重要なのは⼀⼈⽴ちできる研究者になるための基礎となる科学的考え⽅を⾝に着けることです。」と⾔うことを述べている (9)。

11) 理想的な研究者の育成⽅法とは？メンターは何をしてはいけないのか？

以上を総合して考えると、理想的な研究者の育成⽅法とは次のようなことになるのではないだろうか。修⼠課程や博⼠課程の最初の２年間程度は、徹底的に実験の基礎（なぜこのコントロール実験が必要なのかなど）および⾃分の⾏っている実験の意義について、深く考えさせるトレーニングをすることだろう。また批判的に論⽂を読むことのトレーニングも重要だと思う。これらのトレーニングを通じて要求される⽔準に達しない学⽣（つまり主体的に⾃分で考えることのできない学⽣）は、将来的に研究者として⾃⽴できる可能性は⾮常に低く、進路を変えたほうがいい。もちろんこの時期に論⽂を出す必要はないと思う。逆にメンターがこの時期にやってはいけないことは、ラボ全体として論⽂を量産するために、学⽣に実験の意味も説明せずに、⼤きなプロジェクトの中の⻭⾞として働かせ、無給の技術員のように扱う事ではないだろうか？ 「頭を使わなくてもメンターの⾔うことに従っていれば、論⽂が出る」と⼤学院⽣が考えてしまうとしたら、このような指導は⼤学院⽣に対する教育としては最悪の「刷り込み」になってしまうと思う（私もそういう「刷り込み」をしていたのかもしれない）。

最初のステップをうまくクリアした学⽣には、次のステップとしてテーマを与えて時々適切なアドバイスを与えることはあっても、あとは⾃分の考えで実験を勝⼿にやらせることだと思う。⼤学院時代に⼤きな論⽂を完成させることに越したことはないが、研究者としての⻑い⼀⽣を考えるのであれば、その時のプロジェクトが失敗に終わっても全く問題はないと割り切った⽅がいい。もし本⼈が⾃⽴した研究者としての資質が⾝についていれば、⼤きな仕事ができるかどうかは運も関係してくるが、着実に仕事を成し遂げて⾏くことができるだろう。

12) You cannot connect the dots looking forward; you can only connect them looking backward

最近YouTube で、Steven P. Jobs (Steve Jobs)のStanford ⼤学での学位授与式のスピーチをたまたま聴く機会があった( https://www.youtube.com/watch?v=VyzqHFdzBKg)。彼はReed ⼤学という学費の⾼い私⽴⼤学に⼊学後にすぐ中退を決意したが、実際に中退するまでの間に⾃分の興味で、カリグラフのコースをとっていた。彼は「その当時は将来何の役に⽴つかわからなくて習得したカリグラフに関する知識が、10 年後に最初のMacintosh のパソコンの活字体を作成する時に突然蘇ってきた。もしカリグラフのコースを取っていなければ、Macintosh のパソコンは、今のような均等なスペースを有する美しい活字体を取り⼊れることはできなかっただろう。」という話をしていた。彼はその経験をconnecting the dots と表現しており、「将来を⾒据えてdots をつなぎ合わせることはできない、後からしかdots は繋ぎ合わせることはできない」と述懐している。

このことは誰にでも当てはまることだと思う。例えば私は⼤学院に進学する前に肺の病理の研究（私はもともと呼吸器内科の医者だった）をしたいと思い、所属していた呼吸器内科学講座の教授に直談判し、２年間清瀬の結核研究所というところで病理の研究員として働くことになった。しかしこの2 年間は私にとって筆頭著者の論⽂を１本も書くことができず、様々な⼈々にお世話になったものの、「このままここで免疫染⾊や病理解剖をやっていても病気の本体はわからない」という確信を得ただけだった。悶々とした⽇々を送る中で、私はある時、この閉塞状況を打ち破るには⼤学院に進学して、基礎研究をしなくてはならないという結論に達した。⼤学院進学後も、⼈⽣の中でこの2 年間にどの様な価値を⾒いだせるのだろうかとずっと悩んでいた。⼀⽅で私は⼤学院時代に主に培養細胞を⽤いた実験をしていたために、動物実験施設で感染が発⽣した時に、汚染した遺伝⼦改変マウスの世話をするという仕事が回ってきた。動物実験をしている⼈はクリーンなマウスを扱い⾃分の実験をしている中で、全くマウスの実験をしていない⼤学院⽣数名が汚染した環境に存在するマウスを維持するという教授の決定に対して、合理主義的な考え⽅の私は激しく反発を覚え、教授と⼝論になったのを覚えている。しかし⽪⾁なことに順天 堂⼤学に赴任してまもなく⾃分の同定した遺伝⼦の遺伝⼦改変マウスを作成するというプロジェクトを⽴ち上げることになり、この時に遺伝⼦改変マウスを取り扱っていたことが思いもかけず役に⽴つことになった。さらに2010 年頃から細胞死の亢進した遺伝⼦改変マウスを⽤いた研究が私のグループの主な研究テーマとなった。病態モデルマウスの解析をする時になり、免疫染⾊や病理の基礎を学んだ清瀬の結核研究所での2 年間の経験が私の中に急に蘇ってきた。まさにJobs が⾔うように「dots は後からしか繋ぎ合わせることはできない」ということを⾝に染みて感じることになった。このことは「⼈⽣において本当に無駄なことなど何もなく、その時々で⾃分のベストを尽くしていれば、必ずいつかその経験が役に⽴つようになる。」と考えて毎⽇を過ごすことの⼤切さを⽰している。

13) 終わりに

⽇本Cell Death 学会はコロナ感染拡⼤のために、初めて学術集会を中⽌するという事態に⾄っています。学会として何のイベントも⾏わずに、会費だけを徴収するのは不適切だと 考え、理事や⼀部の評議委員の⽅々に⼀連のエッセイの連載をお願いしており、私の記事もその⼀環です。コロナ感染拡⼤⾃体は本当に悲惨な出来事ですが、全ての学会や研究会 などが中⽌になってしまった現在の状況は、もしかしたらサイエンスそのものをじっくり考える時間が増えている⼈もいるのではないかと思われます。コロナ感染拡⼤により様々 な障害が⽣じている現状を、何とか乗り越えて⽇本Cell Death 学会員の⽅々の研究がさらに⾶躍することをお祈りいたします。またこの拙⽂が今後の⼤学院⽣教育の参考に少しで もなれば幸いです。

参考⽂献

著者プロフィール

1984年

千葉⼤学医学部卒業

1989年

財団法⼈結核予防会結核研究所病理 研究員

1995年

千葉大学大学院医学研究科 博士過程（内科系）修了

1995年

順天堂⼤学医学部 助教

2000年

戦略的創造研究推進事業「さきがけ」PRESTO 研究員（兼任）

2001年

順天堂⼤学⼤学院医学研究科 講師

2007年

順天堂⼤学⼤学院医学研究科 准教授

2014年

東邦⼤学医学部医学科 教授

もう 30 年以上も前になるが、私は医学部を卒業して⼤学病院で臨床研修を始めることになり、様々な患者さんの治療に当たることになった。当然のごとく初めての経験であり、多くの⼈たちのアドバイスを聞きながら診療をして⾏くことになったが、困ったのは複数の⼈の意⾒を聞くと、それぞれの意⾒が相反していることもあり、私⾃⾝が混乱してしまうことだった。⼤学院に⼊学して、研究を開始してからも同じ状況が出現することになった。ある実験のトラブルシュートをするときに、複数の⼈からそれぞれ異なったアドバイスを受けると、それを全部やるのは本当に⼤変であり、多くの場合は実験しても positive な結果が得られるわけでもなく、徒労に終わることも多々あった。もちろん⼀部の本当に私の信頼していた⼈からのアドバイスは別だったかもしれない。⾃分の実験がうまくいかない原因を世界の誰よりもよく考えているのは⾃分のはずであり、教授が本当の意味で真剣に私の実験のトラブルシュートを考えてくれているかも疑問だと思っていた。⼀度このようなエピソードがあった。教授のアドバイスに従って実験をしたところ、１つ重要な⾒落としが教授にあり、当然その実験はうまくいかなかった。実験がうまくいかなかった原因として、その点を指摘したところ、「君は私（教授）が間違ったことを⾔っていたとしても、何の確認もせずに、そのまま信じるのか？」と反論された。このような事もあり、また⽣来の私⾃⾝の懐疑主義的な性格もあり、他⼈の意⾒を無批判に取り⼊れる事は⾮常に危険だと思うようになっていた。このような経験をしてきた私は、ある時から「原則として、私は⼈の意⾒は聞かないことにする。⼈の意⾒を聞く時には、既に私の中で⾃分の意⾒は決まっており、それを確認するだけにする。」というように⼼に決め、以後時々このことを公⾔することにしてきた。周囲の⼈から（特に私の家族）は、⼈の意⾒を聞かない、あるいは頑固者というように⾔われてきたが、その後の⼈⽣において私の決断は正しかったと思っている。

プロ野球選⼿（実は私の岳⽗は元プロ野球選⼿であり、惜しくも残り数本で 2000 本安打に届かなかたっというキャリアの持ち主である）が指導される時の悪い例としてよく⾔われることだが、新⼈が⼊ってきた時にコーチが⾃分の流儀で、選⼿の投球フォームやバッテングフォームを⾊々と改造してしまい、結局のところアマチュア時代の⼀番いい状態を台無しにしてしまうという話がある。元ジャイアンツのの投⼿であった桑⽥真澄さんの⽂藝春秋社「Number」誌に掲載された⼿記によると、彼も PL 学園野球部に⼊部した当初は、コーチに⾃分の投球フォームを改造させられてしまい、全く⾃分の投球ができなくなり、⼀時は野球を辞めようとまで思い悩んでいたとの事であった。しかしたまたま、臨時コーチとして赴任してくれた⼈が元の投球ホームを評価してくれたことから投⼿としての野球⼈⽣が復活したことを述べている。

これらのエピソードは極端なものの、ある意味で「⼈の意⾒を聞かないことの重要性」、あるいは「いい意味での頑固さ」が重要であることを物語っている。無批判に素直に他⼈の意⾒を聞いている⼈は、常に「アドバイス地獄」に陥る危険性を孕んでいるのではないだろうか？しかし、誰のアドバイスも受けないというのは⾮現実的であり、なるべく早く⾃分が本当に信頼できる⼈を⾒つけることが実⽣活にとっても、研究にとっても重要だと思う。それが⾃分の所属する講座の教授あるいはその他のスタッフメンバーであることが、学⽣や⼤学院⽣にとっては理想的なことだろう。⾃分が本当に信頼できる⼈の意⾒だけを聞き、その他の⼈の意⾒は聞き流すという鈍感さが研究も含めて⼈⽣において重要な事ではないかと思う。

細胞死との３度の出会い

太⽥先⽣、三浦先⽣と偉⼤な先⽣⽅が理事⻑をされた後で、甚だ実⼒不⾜ですが、この７⽉から理事⻑を務めさせていただくことになりました東邦⼤学医学部⽣化学講座の中野でございます。

私と細胞死との初めての出会いは、⼤学院時代に遡ります。医者にはなったものの臨床医としての限界を感じ、1991 年に私は⼤学院に⼊ることを決意しました。⼤学院⽣として選んだ研究室はT 細胞のシグナル伝達の研究をしていた斎藤隆教授が主宰されており、全く細胞死とは関係のない研究室でした。しかしそこに⽶国のDNAX 研究所から新井賢⼀先⽣の研究室出⾝の宮武先⽣（現⿇布⼤学教授）が助教として赴任され、T 細胞ハイブリドーマで⾒られるactivation-induced cell death (AICD)と細胞周期との関連のプロジェクトを⽴ち上げられ、そのグループ（といってもスタートは2 ⼈だけ）に私が参加したのが細胞死との最初の出会いでした。その後1995 年にLa Jolla Institute for Allergy and ImmunologyにいたDouglas Green らがactivation-induced cell death の本体はTCR 刺激によりFasL が誘導され細胞⾃律的にアポトーシスに陥るという論⽂をNature に出し、結果的には細胞周期とactivation-induced cell death は直接は関係ないという結論になりました。その論⽂が出る前(1993 年)に⻑⽥研にいた須⽥先⽣（現⾦沢⼤学教授）によりFasL のクローニングがなされました。ただ、当時はアポトーシス研究の黎明期であり、哺乳類の最初のカスパーゼであるICE がYuan のラボにいた三浦先⽣によりクローニングされたのが1993 年で、アポトーシス実⾏のメカニズムの⼤部分はブラックボックスでした。当然ゲノムプロジェクトも始まっておらずマウスやヒトで全てのタンパク質をコードする遺伝⼦が何万個あるかもわかっておらず（⼀時は10 万個と⾔われていたこともありました）、かつEST のデータベースさえなかったような時代です。このような時代（1992 年）に本庶先⽣の研究室の⽯⽥靖雄先⽣（現奈良先端技術⼤学准教授）がT cell hybridoma をTCR で刺激してアポトーシスを誘導した時の細胞と、未刺激の細胞からRNA を調製してsubtraction library を作成し、アポトーシスに関係しているだろう遺伝⼦として同定された遺伝⼦がPD (Program cellDeath)-1 でした。今から思えばPD-1 は活性化したT 細胞で発現する遺伝⼦だったわけで す。PD-1 が今のような状況になるとは、その当時は誰も思っていなかったと思います。

なんとか別の仕事をまとめて学位論⽂として発表し、その後1995 年に順天堂⼤学医学部の奥村研究室の助教として赴任しました。赴任後はTRAF5 という遺伝⼦をクローニングし、TNF 受容体を介するシグナル伝達やNF-kB の活性化のメカニズムの研究をしていたのですが、John Reed 研に留学してその後⽇本に帰国された現京⼤教授の⾼橋良輔先⽣（⾼橋先⽣とは⽶国留学前から共通の知⼈を介して⾯識がありました）から1999 年の⽣化学会の細胞死関連のシンポジウムのシンポジストとして招待していただきました。細胞死のシンポジウムで発表させていただく機会を与えていただいたことで、私が細胞死研究を強く意識した２回⽬（2 度⽬の細胞死との出会い）になりました。

その後2001 年に当時医科⻭科⼤学の教授になられていた⼀條先⽣（現東京⼤学教授）から誘われて岡崎の⽣理研の岡⽥泰伸先⽣が毎年世話役として開催されていた「細胞死研究会」に誘っていただいたのが、細胞死との3 度⽬の、かつ私のその後の研究の⽅向性を決めた決定的な出会いになりました。「細胞死研究会」では⽇本の細胞死研究の中核を担っていた⻑⽥重⼀先⽣、辻本賀英先⽣、⽶原伸先⽣、鍔⽥武志先⽣、⾼橋良輔先⽣、⼀條秀憲先⽣、垣塚彰先⽣、三浦正幸先⽣、清⽔重⾂先⽣、仁科博史先⽣、後藤由季⼦先⽣らが参加されておりました。これらの⽅々の前で毎年30 分間⾃分の１年間の研究成果を発表することは胃が痛くなるようなプレッシャーでした。しかしこの研究会は私の⽇本における細胞死研究関連の⼈々との⼈脈を形成する上で⼤きな糧となりましたが、残念ながらこの研究会は岡⽥先⽣が⽣理研の所⻑に就任(2007 年)されご多忙になられたということで2009 年に消滅しました。

⼀⽅1992 年に⼭⽥武先⽣たちが中⼼となって発⾜したアポトーシス研究会は、1997 年に東海アポトーシス研究会と合併し、2009 年に太⽥先⽣の強いリーダーシップのも と⽇本Cell Death 学会へと昇格しました。岡崎の細胞死研究会に参加されていた⼈たちも、Cell Death 学会に参加することになり、現在に⾄っております。⼀⽅で、細胞死研究の新たなハブとなるべく細胞死に関する新学術領域の⽴ち上げは、毎年のように不採択となりながらも地道に継続され、⽥中正⼈先⽣のもとでようやく2014 年に新学術領域「ダイイングコード」が⽴ち上がり、私も微⼒ながら貢献させていただきました。残念ながらこの領域も2019 年３⽉で終了してしまい、現時点で細胞死関連の⼈々が参加し、討論できる場は⽇本Cell Death 学会のみになってしまいました。今後はこの学会をさらに発展させ、若⼿の細胞死研究者の育成や、広く研究者の⼈脈を広げる場としても盛り上げていきたいと思っておりますので、よろしくお願いいたします（⽇本Cell Death 学会Newsletter Vol. 25）。

Murai et al, Nat Commun 2018, 9:4457 (1).

1. はじめに

近年の研究から計画的細胞死にはアポトーシス以外の複数の細胞死が存在することが分子レベルで明らかにされてきており、ネクロプトーシスはその中でも最も研究の進んでいる細胞死である。ネクロプトーシスはTNFなどの細胞死を誘導するサイトカインや、poly(I:C)やある種のウイルス感染などによって誘導されることが明らかにされている。その実行因子はRIPK3と呼ばれるセリンスレオニンキナーゼと、それによりリン酸化され活性化して多量体を形成して細胞膜や核膜へと移行し、膜にポアを形成するMLKLとよばれる分子である。これまでアポトーシスやパイロトーシスをシングルセルレベルでモニタリングすることのできるFRETプローブは三浦らを含めて複数のグループにより開発されてきた。今回我々はネクロプトーシスをモニタリングできるFRETプローブの開発に成功し、幾つかの知見を得たのでここに紹介したい。

2. Fluorescence energy transfer (FRET)とは

FRETは多くの人が知っていると思われるが、簡単にその原理を紹介したい。CFPとYFPのように励起波長の異なる蛍光タンパク質はそれぞれ特異的な励起光を照射することで特定の波長の光を発することになる。しかし、非常にそれぞれの蛍光タンパク質が近接して存在する場合には（1-10 nm）、CFPを励起して生じたエネルギーがYFPを励起して、YFPの蛍光が検出される現象である。これまでYFPとCFPの間にカスパーゼによる切断配列を挿入することで、カスパーゼの活性化にともない挿入したペプチドが切断されることで、それまで生じていたFRETが消失するという現象を利用してカスパーゼの活性化をライブセルでモニタリングすることが可能となっていた。

3. ネクプトーシスに応答するFRETプローブをどのようにデザインするか？

ネクロプトーシスはアポトーシスのように活性化される特異的なプロテーアゼが存在しないことから、我々はRIPK3とMLKLの会合、およびそれにより誘導されるMLKLの高次構造の変化に注目することにした。これまでのX線構造解析の研究からRIPK3のキナーゼドメインがMLKLに会合することにより、MLKLのC末に存在するkinase-like (KL) domainの高次構造が変化することに着目し、いくつかのKL断片をYFP-CFPのリンカー配列に挿入したFRETベクターを構築し、マウス線維芽細胞に一過性に遺伝子導入し、ネクロプトーシス刺激を加えてFRET/CFP比が上昇するかをみる実験を開始した。このプロジェクトを立ち上げる上で最初の難関は、FRET解析をこれまで我々は経験していなかったことから、一過性にMEFsにFRET probeを導入した細胞を東大薬学部の山口先生のところに前日に持っておき、翌日にまた東大に行き細胞を刺激してFRETが誘導されるかどうかを検討するというステップを論文の筆頭著者の村井助教が繰り返さなくてはならないことであった。当初は何度やってもうまくいかず、山口先生とも相談してプロジェクトをやめようと考え、最期にネクロプトーシスの起こりやすい細胞として有名なL929細胞でやってみようとしたところ、予想外にうまくいくことがわかったのが、プロジェクトを開始してから既に１年半が過ぎようとしていた。

4. SMARTの誕生まで

当初a14と名前をつけたプローブでうまくネクロプトーシスに伴いFRETが誘導されたが、解決しなくてはならない問題が2つ残っていた。一つは安定的なシグナルを得るために恒常的な発現細胞を得ることと、2つめはFRETが起こるメカニズムの解明であった。どうもa14は細胞に毒性を発揮するために恒常的発現細胞が取れないらしいということがわかり、村井助教のアイデアで、アルファヘリックス構造を取る幾つかの領域を除いて、SAGGと呼ばれるリンカー配列に置換したベクターを構築したところ恒常的な発現細胞をとることができた。そこでこのFRETセンサーをSMART (a Sensor for MLKL activation by RIPK3 based on FRET)と命名した。その後マウスversionだけでなく、ヒトversionのSMARTの作成にも成功した。SMARTの活性化されるメカニズムはNec-1, GSK’872, NSA, Ripk3 siRNA, Mlkl siRNA, Mlkl KO細胞などのさまざまな実験を行い、現時点ではSMARTは多量化したMLKLの形質膜への移行をモニタリングしていると結論をつけている(2)。

5. SMARTとDMAPsの放出のイメージング

最期にDAMPsとネクロプトーシスとのイメージングの解析から得られた新しい知見について述べたい。DAMPsは一般的にはネクロプトーシスも含めて早期に細胞膜に障害が誘導されるような細胞死で放出されると考えられてきた。しかし、放出がどのように制御されているかについて、また細胞内に存在する核膜などの形質膜がどのように障害されるかについては十分に解明されていなかった。今回我々はHMGB1放出を一つのDAMPsのモデルとして、ネクロプトーシスに見られるHMGB1放出のメカニズムの解析を行った。この解析には東大の白崎先生らの開発したTIRFを用いたシングルセルレベルでのサイトカイン放出を検出することのできる技術（Live-Cell Imaging of Secretion activity : LCI-S）が威力を発揮することになった(3)。IL-1βなどのサイトカインの場合には高感度のELISA系が確立されていることから、シングルセルレベルで放出されたIL-1βをLCI-Sで検出できることを白崎先生らは報告していたが(4)、HMGB1の場合には複数の抗体を検討した結果、そのような高感度のEISAは現時点では組むことができないことが判明した。ここで障害にぶちあたったが、ある時にふと細胞にHMGB1-mCherry融合タンパク質を発現させ、さらにHMGB1の抗体ではなく、anti-mCherry抗体でマイクロウェルを固相化することでうまく検出できるのではないかというアイデアを思いついた。それを検証してみたところ予想外にうまくいくことがわかり、HMGB1の放出を１細胞レベルでイメージングすることに成功した。

6. HMGB1放出の2つのモードの発見

さらに興味深いことにL929-SMART/HMGB1-mCherry細胞を用いた解析からHMGB1の放出には放出開始から10分以内に消失してしまうburst-mode細胞と、放出の持続が120分も継続するsustained-modeの２種類の細胞が存在することが判明した。細胞膜の修復に関与すると考えられるESCRT-III複合体の１つのサブユニットであるCHMP4Bという遺伝子をノックダウンしたところsustained-modeを示す細胞が消失し、すべての細胞がburst-modeになることが明らかとなった。現在この生理的あるいは病理的な意義は不明だが、CHMP4Bはウイルスのbuddingに関連していること、CHMP4Bの発現はIFNなどにより発現が低下すること、IFNβはMLKLの発現を上昇させることなどを考慮すると、我々の細胞がウイルスに感染されネクロプトーシスに陥る時には、すべての細胞をburst-modeに変換して、周囲に強い炎症を誘導するというようなメカニズムが存在している可能性もあり非常に興味深い現象と考えられる。

7. 最後に

このプロジェクトで中心的に仕事を行った村井助教も私もFRETのノウハウも知識も持たないまったくの素人の研究者であり、新学術領域の人的なサポートがあってこそ初めて成功したプロジェクトであった。特に東大薬学部の三浦先生、現在北大に移られた山口先生、東大理学部の白崎先生らの協力がなければこのプロジェクトは成功していなかった。またプロジェクトの途中でさまざまな難問が出現したにもかかわらず、なんとか論文の採択までにいたることができたのはひとえに村井助教の頑張りだったと考えられる。このプロジェクトは2014年に私が東邦大学医学部生化学講座に赴任してから始まり、最初に論文を投稿したのが2017年6月であり、最終的にはアクセプトが2018年10月であった。このプロジェクトは丸4年半もの年月がかかったことになる。現在はダイイングコードの班が終了する前にこの論文を上梓することができ、多少なりともこの領域に貢献できたと安堵しているところである。

参考文献

　（新学術領域ダイイングコードニュースレターNo.4 2019年1月）

　英語を母国語とする国を訪問するときに常に思い浮かんでくる自分への問いかけがある。それは「もし自分が英語を母国語とした国に生まれて教育を受けていたら、自分の研究のレベルはもっと高かっただろうか？」という問いである。
今回私は2018年8月5-10日まで米国メーン州のNewryというスキーリゾート地で開催されたCell Deathについてのゴードンカンファレンスに参加すべく、米国に出張することになった。そこでついでにサンフランシスコに立ち寄り、順天堂大学医学部免疫学講座時代の知り合いの 榧垣伸彦博士を訪問することになった。米国サンフランシスコにあるバイオベンチャー企業の草分けのひとつであるGenentech社は薬の開発だけでなく、数々の優れた論文を発表する企業としても有名である。まず最初に驚いたことは、サンフランシスコ空港の周辺がバイオベンチャーのオフィスやホテルの建築ラッシュであることであった。日本の企業の武田薬品も一時期この場所に研究所を持っていたが、現在では撤退しており、その建物はGenentech社が買収しているらしい。 訪問して驚いたのはGenentech社での研究は完全に分業化されており、例えばlarge prepをやろうと思えば、大腸菌をcultureしたペレットを持って行けば、担当の部署の人間がやってくれるということであった。cDNAをとる場合にも、よほど長い遺伝子でなければPCRなどせずに、合成オリゴを受注するとのことであった。また榧垣さんの下にはスタンフォード大を出て既に博士号を取得している優秀な技術員が４〜５名おり（技術員の給料を聞くと、日本の大学教授より高給なのにさらに驚いた）、榧垣さん自身はほとんどその人達に指示を出すだけということであった。さらにラボには大量に研究のための試薬などの消耗品のストックルームがあり（まるでお店のよう）、必要であればそこから消耗品を取っていくということであった。遺伝子改変マウスもこの遺伝子の欠損マウスを作成して欲しいという依頼をかけるだけで、CRISPR/Cas9法で作成してくれるらしい。このような研究環境は、研究者にとっては天国のような環境だが、それは成功し続けるこのとのできる一部の特別に優秀な研究者だけに与えられたものであり、ひとたび研究成果が出なくなると、自分の配下のポスドクや技術員も減らされ、最終的には会社を辞めていかざるえないような状況になるとのことであった。榧垣さん自身もずっとGenentech社でtop journalを出し続けることは難しいと考えているようで、この企業がダメであれば、また次の企業へと移っていくことに何ら抵抗がないようで、人間の流動性がやはり米国社会を支える源であることを再度確認するに至った。彼のボスであるVishva Dixit（ケニア系のインド人）のグループは細胞死研究やインフラマソームの研究で世界をリードする研究グループの一つであり、この研究室の榧垣さんやKim Newtonらが次々とNatureやScienceなどのtop journalへ論文を発表している。榧垣さんの話では、会社のboard membersの前でpresentationをし、そのメンバーの人たちが納得すれば100万ドル（日本円で1億円以上）程度の予算を確保することができるという話で、ENU のmutagenesisを用いたマウスの大規模スクリーニングを用いたGasdermin Dの同定は(Nature)、このような予算でまかなわれたということであった。
　今回の訪問では、VishvaとDomagoi Vucicは休暇で不在であったが、KimやDomogoiの下で働いているロシア人のEugene Varfolomeev、最近Natureに論文を出したドイツ人のポスドクのKlaus Heger、ハーバードで６年間PhDコースにいた中国人のポスドクのJieqiong Zhang、Cancer immunologyをやっているPIのAdita Murthyとdiscussionすることができた。またセミナーで発表する機会もいただき、SMARTと命名したネクロプトーシスのbiosensorを用いたimagingにセミナーの参加者は興味を持ってくれたようで、SMARTのトランスジェニックマウス作成しているのかという質問も受けた。その後榧垣さんにサンフランシスコ郊外のレストランに車で連れて行ってもらい夕食をご馳走になり、時差ボケも残る中、多忙な1日が終わった。
　翌日は昼の飛行機でボストンへと向かったが、ボストンに到着したのは午後10時をすぎており、baggage claimで今回一緒に参加することになっている大学院生の三浦君と落ち合い、二人で深夜のボストンの街をタクシーで、飛行場近くのモーテルまで行くことになった。運が悪いことに一緒に参加することになっていた村井助教は飛行機が遅れたために、我々よりもさらに遅くモーテルに到着し、その日は３人とも外で食事を取る気もおこらず、へとへとに疲れて就寝することになった。翌日は学会場（メーン州のスキーリゾートホテル）までボストンの飛行場の近くのホテルからバスで４時間かけて移動することになっていた。バスの発着場についたところ、今回参加することになっていた田中ラボの四元さんと一緒になることができた。バスを待つ会場でKimとばったり出会い、またオーストラリアのPeter Czabotarとまたこれも偶然出会い立ち話をしたりしながら、バス出発までの時間を潰す間に、バスの出発の時間になった。その後４時間をかけ、ボストンから離れた学会場に到着し、その日はWellcome partyとHenning WalczackとAndreas Strasserのkeynote talkが行われた。
　さて翌日からinvited speakersとsubmitしたabstractから選ばれた人間によるshort talkが行われた。予想通り日本からの参加者はそれほど多くなかったものの、私の研究室から私を含めて3名が参加し、日本人はinvited speakerの長田先生を含め3名しかoral presentationをする機会が与えられない中で、村井助教が選ばれたということは（もう一人は米国のラボに留学している日本人のポスドク）、我々のFRETセンサーを用いたネクロプトーシスのimagingに、知り合いでVice ChairをしていたFrancis K. Chanが興味を持ってくれたためと考えられた。学会場では活発な討論が行われており、初めて国際学会に参加した三浦君や田中ラボの四元助教も頑張っていたと思う。村井助教の発表には、RIPK1の機能解析を精力的にやっているPascal Meierが興味を持ってくれ、早速共同研究を始めることになった。最終日のバンケットでは、日本人が合計で8名参加していたこともあり、長田先生は終始上機嫌であった。私も海外の学会で写真撮影をすることなどこれまではほとんどなかったが、今回は長田先生、オーストラリアのJohn Silkeと一緒に写真を撮らせていただいた。
　この学会の最後の難関は、参加者全員が乗車することになっている翌日午前９時ホテル発のバスでは、その日に日本へ帰国する飛行機に搭乗できないことから、午前8時のボストンでの飛行機に搭乗するために午前２時にホテルを出発することであった。Francisにこのことを話すと彼はお金もかかるしcrazyだと言っていたが、無事に電話で予約したタクシーも到着し、全員が寝坊することなくボストンの空港に到着することができた。トランジットのシカゴ空港では、帰国の飛行機の便が違うにもかかわらず長田先生と通路で偶然出くわしてしまうというオマケまでついた。そういえば30年以上前にボストン博物館の中を歩いていたら偶然知人に出会ったことや、ニューヨークの空港で飛行機を待っていたところ、大学の同級生に会ったこともあり、私はもしかしたら自分の人生の運を人との偶然の出会い（出会いを熱望していない人）で消費しているかもしれない（長田先生すいません）。

　（日本Cell death学会ニュースレター 2018年12月）

東邦大学医学部に赴任する直前に日本Cell Death学会前理事長の太田成男先生から、次の学会の会頭を中野さんがやりませんかというお声をかけていただきました。太田先生曰く、「中野さん、大きな学会の会長（私は別に学会の会長をやりたいとも思っていませんでしたが）をやる前には、小さな学会の会長をやるのは練習になっていいものですよ」というようなニュアンスのことを言われて説得されたように記憶しております。その時には赴任直後ということもあり、１〜２年後であればお引き受けいたしますと返事を差し上げたところ、今回学会頭をお引き受けすることになりました。
　皆様もご存知のように現在の日本の科学研究を取り巻く状況は日に日に厳しくなっていると思われます。国立大学の運営交付金が削減され、その結果として科学研究費を含めて外部資金の獲得のために激しい競争が繰り広げられております。当然のごとく大学の教員の数も削減せざるをえない傾向にあり、博士研究員のような臨時雇用にもかかわらず人聞きがいいということで特任助教などのポストが乱造される状況に至っています。この変化は大学にとどまらず学会の開催のための企業からの寄付金は広告費の減少、あるいは学会の参加者数の減少という形で学会の開催及び運営の困難さを招いています。この学会もこの例外ではありませんでした。当初の予想どおり企業からの寄付は非常に厳しいものでしたが、幸いにも私の恩師であります順天堂大学アトピーリサーチセンター長の奥村康教授、私の順天堂大学時代からの友人であります脳神経内科学教授の服部信孝先生のお声かけで、なんとか学会を開催するための寄付が集まり学術集会を無事開催することができました。心からお礼を申し上げます。
　今回の学会で目指したのはなるべく多くの方にポスター発表をしてもらい、かつ質の高い面白いシンポジウムを企画することでした。シンポジウムの座長として東京大学の一條秀憲先生、東京医科歯科大学の清水重臣先生、東京薬科大学の田中正人先生、京都大学の鈴木淳先生、高橋良輔先生、椛島健治先生らに素晴らしい企画をしていただきました。またFasの発見者で日本の細胞死研究の草分けであります京都大学の米原伸先生、哺乳類細胞のカスパーゼの最初の発見者であり日本の細胞死研究を牽引されている東京大学の三浦正幸先生に特別講演を賜りました。私事で恐縮ですが、今回シンポジストで発表していただいた方々の一部の方は、岡田泰伸先生が世話人になり1990年代の後半〜2010年まで岡崎生理学研究所で毎年１回行われた「細胞死研究会」にコアメンバーとして参加されていた人たちです。私もその研究会の末席に参加させていただき、毎年胃が痛くなるようなプレッシャーの中で発表するという貴重な体験をさせていただきました。現在ではそのような会を開催することができなくなってしまい、非常に残念でなりません。今後はこの日本Cell Death学会をハブとして、そのような会にすることができればと思っております。
　また今回は新しい企画として若手研究者をいかに海外に派遣して、活躍してもらうかについてのパネルデイスカッションを企画しました。昨年ドイツのケルン大学教授のManolis Pasparakis博士が私のラボを訪問し、セミナ−をしてくれた時に、ドイツではpromotionするためには外国に留学することが非常に重要だというような話をされていました。一方で、現在の日本では科学研究を取り巻く環境の悪化に伴い、海外に留学する若手研究者の減少や、外国のラボとの共同研究数が減少していることが問題になっております。これについては文部科学省も色々なグラントを新規に設けて、海外への若手研究者の派遣や海外との共同研究を促進しようと模索している状況です。今回のパネルデイスカッションでは、海外でポスドクとして研究をすることの素晴らしさなどを紹介していただきました。しかし、一方で海外からなかなか日本に帰国するときに魅力的なポストを日本の大学を含めた研究機関が十分に提供できていないのではないかという問題については、十分な議論ができなかったように思います。おそらく最も問題な点は、海外で仕事がうまくいかずに論文が出なかったポスドクに対して、日本の企業や大学などがポストを提供できるようなバックアップシステムを構築できていない点ではないかと思っております。研究の世界には当然競争の原理は必要ですが、敗者復活戦のような社会環境を構築しておく必要があると思われます。今後この点については、文部科学省、大学、企業や様々な学会を含めて十分検討していく必要があると感じております。
　最後になりますが、今回の学会は参加していただいた研究者の皆様、ご寄付をいただいた企業の皆様、また裏方として頑張ってくれた東邦大学医学部生化学講座のスタッフメンバー全員のおかげで無事終了することができました。最後に深謝したいと思います。また太田先生におきましては、貴重な経験をさせていただき有難うございました。

1. はじめに

制御された細胞死としてネクロプトーシスへと至る大筋の分子メカニズムが明らかにされ、ネクロプトーシスとアポトーシスとの相互の関連も含めて多くの謎が解明されつつある。本稿では簡単にネクロプトーシス経路を説明し、さらに現時点でのネクロプトーシスに関して未解決の点について議論したい。

2. ネクロプトーシス誘導経路

ネクロプトーシスの本来の定義は、セリンスレオニンキナーゼであるReceptor-interacting protein kinase (RIPK)1キナーゼの阻害剤であるNecrostatin (Nec)-1により阻害されるネクローシス様の細胞死である1。しかし、現実的にはRIPK1の下流に存在し、ネクロプトーシス誘導に関与するRIPK3やMLKL（詳細は以下を参照）に依存する細胞死（時にはRIPK1非依存性の場合もあるが）を総称して、ネクロプトーシスということも多い。TNFαが受容体に会合しても多くの細胞では細胞死が誘導されない。この場合には複合体Iと呼ばれる転写因子NF-κBを活性化する複合体が細胞膜上で形成される。複合体Iの形成には直鎖型ユビキチン鎖やK63型ユビキチン鎖などにより様々なアダプター分子、キナーゼ分子、ユビキチン化酵素などが会合してくるが、詳細はNF-κB活性化の総説を参照されたい。一方でタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド存在下でTNFαの刺激を加えた場合には、詳細は不明だが（おそらくcFLIPの発現が低下した結果）、TRADD/FADD/Caspase 8からなる複合体IIaが形成される2,3（図1）。一方で、IAP阻害剤(BV6など)やNF-κBの活性化が抑制された状況では、RIPK1/RIPK3/FADD/Caspase 8からなる複合体IIbが形成される。複合体IIaや複合体IIbが存在する状況で、さらにzVAD-fmkやcFLIPsなどのカスパーゼ8が阻害されると、RIPK1/RIPK3/MLKLと呼ばれるネクロソームが形成され、その結果ネクロプトーシスが誘導されることが明らかにされている。複合体IIaと複合体IIbにより誘導されるアポトーシスの質的な相違は、複合体IIbはRIPK1のキナーゼ阻害剤であるNec-1で阻害できるが、複合体IIaはNec-1によって阻害されないことである。両複合体ともにカスパーゼ阻害剤であるzVAD-fmk処理により、RIPK3の発現している細胞では、アポトーシスは抑制されるものの、ネクロプトーシスが誘導されることになる。例えばRIPK3の発現していないHeLa細胞ではTNFα + CHX刺激、あるいはTNFα + BV6刺激による細胞死は、zVAD-fmkで完全に抑制される。しかし、RIPK3の発現しているHT29細胞ではいずれの刺激においてもzVAD-fmkを投与すると、ネクロプトーシスが誘導され、Nec-1を同時に投与することで、完全に細胞死が抑制される。この現象は、in vivoにおいてどのような状況で複合体IIaが形成され、あるいは複合体IIbが形成されるかについての結論は出ていないが、アポトーシス阻害剤を投与する上での副作用を考慮する点で非常に重要である。
　一般的にアポトーシス経路はネクロプトーシス経路を阻害すると考えられ、ネクロプトーシスの誘導にはカスパーゼ阻害剤を併用することが多い。この理由としてはCaspase 8と細胞死抑制因子であるlong formのcFLIPがヘテロダイマーを形成することで、ネクロプトーシス誘導に必須の分子であるRIPK1, RIPK3やRIPK1を脱ユビキチン化する酵素であるCylindromatosis (CYLD)の機能を切断することで、不活性化するのではないかと考えられている2。

3. ネクロプトーシス　ー現状と今後解明すべき問題点についてー

参考文献

• 図1. TNFαにより誘導される細胞死誘導経路。 多くの細胞ではTNFαは細胞死を誘導せず、NF-κBの活性化に関与する複合体Iを誘導する。TNFα刺激はシクロヘキシミド存在化では複合体IIaを誘導し、IAP阻害剤やNF-κBの活性化の障害された細胞では複合体IIbを誘導する。複合体IIaやIIbがzVAD-fmkやcFLIPsなどの存在化ではネクロソームが形成される。複合体IIaやIIbはアポトーシスを誘導し、ネクロソームはネクロプトーシスを誘導する。