Murai et al, Nat Commun 2018, 9:4457 (1).

1. はじめに

近年の研究から計画的細胞死にはアポトーシス以外の複数の細胞死が存在することが分子レベルで明らかにされてきており、ネクロプトーシスはその中でも最も研究の進んでいる細胞死である。ネクロプトーシスはTNFなどの細胞死を誘導するサイトカインや、poly(I:C)やある種のウイルス感染などによって誘導されることが明らかにされている。その実行因子はRIPK3と呼ばれるセリンスレオニンキナーゼと、それによりリン酸化され活性化して多量体を形成して細胞膜や核膜へと移行し、膜にポアを形成するMLKLとよばれる分子である。これまでアポトーシスやパイロトーシスをシングルセルレベルでモニタリングすることのできるFRETプローブは三浦らを含めて複数のグループにより開発されてきた。今回我々はネクロプトーシスをモニタリングできるFRETプローブの開発に成功し、幾つかの知見を得たのでここに紹介したい。

2. Fluorescence energy transfer (FRET)とは

FRETは多くの人が知っていると思われるが、簡単にその原理を紹介したい。CFPとYFPのように励起波長の異なる蛍光タンパク質はそれぞれ特異的な励起光を照射することで特定の波長の光を発することになる。しかし、非常にそれぞれの蛍光タンパク質が近接して存在する場合には（1-10 nm）、CFPを励起して生じたエネルギーがYFPを励起して、YFPの蛍光が検出される現象である。これまでYFPとCFPの間にカスパーゼによる切断配列を挿入することで、カスパーゼの活性化にともない挿入したペプチドが切断されることで、それまで生じていたFRETが消失するという現象を利用してカスパーゼの活性化をライブセルでモニタリングすることが可能となっていた。

3. ネクプトーシスに応答するFRETプローブをどのようにデザインするか？

ネクロプトーシスはアポトーシスのように活性化される特異的なプロテーアゼが存在しないことから、我々はRIPK3とMLKLの会合、およびそれにより誘導されるMLKLの高次構造の変化に注目することにした。これまでのX線構造解析の研究からRIPK3のキナーゼドメインがMLKLに会合することにより、MLKLのC末に存在するkinase-like (KL) domainの高次構造が変化することに着目し、いくつかのKL断片をYFP-CFPのリンカー配列に挿入したFRETベクターを構築し、マウス線維芽細胞に一過性に遺伝子導入し、ネクロプトーシス刺激を加えてFRET/CFP比が上昇するかをみる実験を開始した。このプロジェクトを立ち上げる上で最初の難関は、FRET解析をこれまで我々は経験していなかったことから、一過性にMEFsにFRET probeを導入した細胞を東大薬学部の山口先生のところに前日に持っておき、翌日にまた東大に行き細胞を刺激してFRETが誘導されるかどうかを検討するというステップを論文の筆頭著者の村井助教が繰り返さなくてはならないことであった。当初は何度やってもうまくいかず、山口先生とも相談してプロジェクトをやめようと考え、最期にネクロプトーシスの起こりやすい細胞として有名なL929細胞でやってみようとしたところ、予想外にうまくいくことがわかったのが、プロジェクトを開始してから既に１年半が過ぎようとしていた。

4. SMARTの誕生まで

当初a14と名前をつけたプローブでうまくネクロプトーシスに伴いFRETが誘導されたが、解決しなくてはならない問題が2つ残っていた。一つは安定的なシグナルを得るために恒常的な発現細胞を得ることと、2つめはFRETが起こるメカニズムの解明であった。どうもa14は細胞に毒性を発揮するために恒常的発現細胞が取れないらしいということがわかり、村井助教のアイデアで、アルファヘリックス構造を取る幾つかの領域を除いて、SAGGと呼ばれるリンカー配列に置換したベクターを構築したところ恒常的な発現細胞をとることができた。そこでこのFRETセンサーをSMART (a Sensor for MLKL activation by RIPK3 based on FRET)と命名した。その後マウスversionだけでなく、ヒトversionのSMARTの作成にも成功した。SMARTの活性化されるメカニズムはNec-1, GSK’872, NSA, Ripk3 siRNA, Mlkl siRNA, Mlkl KO細胞などのさまざまな実験を行い、現時点ではSMARTは多量化したMLKLの形質膜への移行をモニタリングしていると結論をつけている(2)。

5. SMARTとDMAPsの放出のイメージング

最期にDAMPsとネクロプトーシスとのイメージングの解析から得られた新しい知見について述べたい。DAMPsは一般的にはネクロプトーシスも含めて早期に細胞膜に障害が誘導されるような細胞死で放出されると考えられてきた。しかし、放出がどのように制御されているかについて、また細胞内に存在する核膜などの形質膜がどのように障害されるかについては十分に解明されていなかった。今回我々はHMGB1放出を一つのDAMPsのモデルとして、ネクロプトーシスに見られるHMGB1放出のメカニズムの解析を行った。この解析には東大の白崎先生らの開発したTIRFを用いたシングルセルレベルでのサイトカイン放出を検出することのできる技術（Live-Cell Imaging of Secretion activity : LCI-S）が威力を発揮することになった(3)。IL-1βなどのサイトカインの場合には高感度のELISA系が確立されていることから、シングルセルレベルで放出されたIL-1βをLCI-Sで検出できることを白崎先生らは報告していたが(4)、HMGB1の場合には複数の抗体を検討した結果、そのような高感度のEISAは現時点では組むことができないことが判明した。ここで障害にぶちあたったが、ある時にふと細胞にHMGB1-mCherry融合タンパク質を発現させ、さらにHMGB1の抗体ではなく、anti-mCherry抗体でマイクロウェルを固相化することでうまく検出できるのではないかというアイデアを思いついた。それを検証してみたところ予想外にうまくいくことがわかり、HMGB1の放出を１細胞レベルでイメージングすることに成功した。

6. HMGB1放出の2つのモードの発見

さらに興味深いことにL929-SMART/HMGB1-mCherry細胞を用いた解析からHMGB1の放出には放出開始から10分以内に消失してしまうburst-mode細胞と、放出の持続が120分も継続するsustained-modeの２種類の細胞が存在することが判明した。細胞膜の修復に関与すると考えられるESCRT-III複合体の１つのサブユニットであるCHMP4Bという遺伝子をノックダウンしたところsustained-modeを示す細胞が消失し、すべての細胞がburst-modeになることが明らかとなった。現在この生理的あるいは病理的な意義は不明だが、CHMP4Bはウイルスのbuddingに関連していること、CHMP4Bの発現はIFNなどにより発現が低下すること、IFNβはMLKLの発現を上昇させることなどを考慮すると、我々の細胞がウイルスに感染されネクロプトーシスに陥る時には、すべての細胞をburst-modeに変換して、周囲に強い炎症を誘導するというようなメカニズムが存在している可能性もあり非常に興味深い現象と考えられる。

7. 最後に

このプロジェクトで中心的に仕事を行った村井助教も私もFRETのノウハウも知識も持たないまったくの素人の研究者であり、新学術領域の人的なサポートがあってこそ初めて成功したプロジェクトであった。特に東大薬学部の三浦先生、現在北大に移られた山口先生、東大理学部の白崎先生らの協力がなければこのプロジェクトは成功していなかった。またプロジェクトの途中でさまざまな難問が出現したにもかかわらず、なんとか論文の採択までにいたることができたのはひとえに村井助教の頑張りだったと考えられる。このプロジェクトは2014年に私が東邦大学医学部生化学講座に赴任してから始まり、最初に論文を投稿したのが2017年6月であり、最終的にはアクセプトが2018年10月であった。このプロジェクトは丸4年半もの年月がかかったことになる。現在はダイイングコードの班が終了する前にこの論文を上梓することができ、多少なりともこの領域に貢献できたと安堵しているところである。

参考文献

　（新学術領域ダイイングコードニュースレターNo.4 2019年1月）

　英語を母国語とする国を訪問するときに常に思い浮かんでくる自分への問いかけがある。それは「もし自分が英語を母国語とした国に生まれて教育を受けていたら、自分の研究のレベルはもっと高かっただろうか？」という問いである。
今回私は2018年8月5-10日まで米国メーン州のNewryというスキーリゾート地で開催されたCell Deathについてのゴードンカンファレンスに参加すべく、米国に出張することになった。そこでついでにサンフランシスコに立ち寄り、順天堂大学医学部免疫学講座時代の知り合いの 榧垣伸彦博士を訪問することになった。米国サンフランシスコにあるバイオベンチャー企業の草分けのひとつであるGenentech社は薬の開発だけでなく、数々の優れた論文を発表する企業としても有名である。まず最初に驚いたことは、サンフランシスコ空港の周辺がバイオベンチャーのオフィスやホテルの建築ラッシュであることであった。日本の企業の武田薬品も一時期この場所に研究所を持っていたが、現在では撤退しており、その建物はGenentech社が買収しているらしい。 訪問して驚いたのはGenentech社での研究は完全に分業化されており、例えばlarge prepをやろうと思えば、大腸菌をcultureしたペレットを持って行けば、担当の部署の人間がやってくれるということであった。cDNAをとる場合にも、よほど長い遺伝子でなければPCRなどせずに、合成オリゴを受注するとのことであった。また榧垣さんの下にはスタンフォード大を出て既に博士号を取得している優秀な技術員が４〜５名おり（技術員の給料を聞くと、日本の大学教授より高給なのにさらに驚いた）、榧垣さん自身はほとんどその人達に指示を出すだけということであった。さらにラボには大量に研究のための試薬などの消耗品のストックルームがあり（まるでお店のよう）、必要であればそこから消耗品を取っていくということであった。遺伝子改変マウスもこの遺伝子の欠損マウスを作成して欲しいという依頼をかけるだけで、CRISPR/Cas9法で作成してくれるらしい。このような研究環境は、研究者にとっては天国のような環境だが、それは成功し続けるこのとのできる一部の特別に優秀な研究者だけに与えられたものであり、ひとたび研究成果が出なくなると、自分の配下のポスドクや技術員も減らされ、最終的には会社を辞めていかざるえないような状況になるとのことであった。榧垣さん自身もずっとGenentech社でtop journalを出し続けることは難しいと考えているようで、この企業がダメであれば、また次の企業へと移っていくことに何ら抵抗がないようで、人間の流動性がやはり米国社会を支える源であることを再度確認するに至った。彼のボスであるVishva Dixit（ケニア系のインド人）のグループは細胞死研究やインフラマソームの研究で世界をリードする研究グループの一つであり、この研究室の榧垣さんやKim Newtonらが次々とNatureやScienceなどのtop journalへ論文を発表している。榧垣さんの話では、会社のboard membersの前でpresentationをし、そのメンバーの人たちが納得すれば100万ドル（日本円で1億円以上）程度の予算を確保することができるという話で、ENU のmutagenesisを用いたマウスの大規模スクリーニングを用いたGasdermin Dの同定は(Nature)、このような予算でまかなわれたということであった。
　今回の訪問では、VishvaとDomagoi Vucicは休暇で不在であったが、KimやDomogoiの下で働いているロシア人のEugene Varfolomeev、最近Natureに論文を出したドイツ人のポスドクのKlaus Heger、ハーバードで６年間PhDコースにいた中国人のポスドクのJieqiong Zhang、Cancer immunologyをやっているPIのAdita Murthyとdiscussionすることができた。またセミナーで発表する機会もいただき、SMARTと命名したネクロプトーシスのbiosensorを用いたimagingにセミナーの参加者は興味を持ってくれたようで、SMARTのトランスジェニックマウス作成しているのかという質問も受けた。その後榧垣さんにサンフランシスコ郊外のレストランに車で連れて行ってもらい夕食をご馳走になり、時差ボケも残る中、多忙な1日が終わった。
　翌日は昼の飛行機でボストンへと向かったが、ボストンに到着したのは午後10時をすぎており、baggage claimで今回一緒に参加することになっている大学院生の三浦君と落ち合い、二人で深夜のボストンの街をタクシーで、飛行場近くのモーテルまで行くことになった。運が悪いことに一緒に参加することになっていた村井助教は飛行機が遅れたために、我々よりもさらに遅くモーテルに到着し、その日は３人とも外で食事を取る気もおこらず、へとへとに疲れて就寝することになった。翌日は学会場（メーン州のスキーリゾートホテル）までボストンの飛行場の近くのホテルからバスで４時間かけて移動することになっていた。バスの発着場についたところ、今回参加することになっていた田中ラボの四元さんと一緒になることができた。バスを待つ会場でKimとばったり出会い、またオーストラリアのPeter Czabotarとまたこれも偶然出会い立ち話をしたりしながら、バス出発までの時間を潰す間に、バスの出発の時間になった。その後４時間をかけ、ボストンから離れた学会場に到着し、その日はWellcome partyとHenning WalczackとAndreas Strasserのkeynote talkが行われた。
　さて翌日からinvited speakersとsubmitしたabstractから選ばれた人間によるshort talkが行われた。予想通り日本からの参加者はそれほど多くなかったものの、私の研究室から私を含めて3名が参加し、日本人はinvited speakerの長田先生を含め3名しかoral presentationをする機会が与えられない中で、村井助教が選ばれたということは（もう一人は米国のラボに留学している日本人のポスドク）、我々のFRETセンサーを用いたネクロプトーシスのimagingに、知り合いでVice ChairをしていたFrancis K. Chanが興味を持ってくれたためと考えられた。学会場では活発な討論が行われており、初めて国際学会に参加した三浦君や田中ラボの四元助教も頑張っていたと思う。村井助教の発表には、RIPK1の機能解析を精力的にやっているPascal Meierが興味を持ってくれ、早速共同研究を始めることになった。最終日のバンケットでは、日本人が合計で8名参加していたこともあり、長田先生は終始上機嫌であった。私も海外の学会で写真撮影をすることなどこれまではほとんどなかったが、今回は長田先生、オーストラリアのJohn Silkeと一緒に写真を撮らせていただいた。
　この学会の最後の難関は、参加者全員が乗車することになっている翌日午前９時ホテル発のバスでは、その日に日本へ帰国する飛行機に搭乗できないことから、午前8時のボストンでの飛行機に搭乗するために午前２時にホテルを出発することであった。Francisにこのことを話すと彼はお金もかかるしcrazyだと言っていたが、無事に電話で予約したタクシーも到着し、全員が寝坊することなくボストンの空港に到着することができた。トランジットのシカゴ空港では、帰国の飛行機の便が違うにもかかわらず長田先生と通路で偶然出くわしてしまうというオマケまでついた。そういえば30年以上前にボストン博物館の中を歩いていたら偶然知人に出会ったことや、ニューヨークの空港で飛行機を待っていたところ、大学の同級生に会ったこともあり、私はもしかしたら自分の人生の運を人との偶然の出会い（出会いを熱望していない人）で消費しているかもしれない（長田先生すいません）。

　（日本Cell death学会ニュースレター 2018年12月）

東邦大学医学部に赴任する直前に日本Cell Death学会前理事長の太田成男先生から、次の学会の会頭を中野さんがやりませんかというお声をかけていただきました。太田先生曰く、「中野さん、大きな学会の会長（私は別に学会の会長をやりたいとも思っていませんでしたが）をやる前には、小さな学会の会長をやるのは練習になっていいものですよ」というようなニュアンスのことを言われて説得されたように記憶しております。その時には赴任直後ということもあり、１〜２年後であればお引き受けいたしますと返事を差し上げたところ、今回学会頭をお引き受けすることになりました。
　皆様もご存知のように現在の日本の科学研究を取り巻く状況は日に日に厳しくなっていると思われます。国立大学の運営交付金が削減され、その結果として科学研究費を含めて外部資金の獲得のために激しい競争が繰り広げられております。当然のごとく大学の教員の数も削減せざるをえない傾向にあり、博士研究員のような臨時雇用にもかかわらず人聞きがいいということで特任助教などのポストが乱造される状況に至っています。この変化は大学にとどまらず学会の開催のための企業からの寄付金は広告費の減少、あるいは学会の参加者数の減少という形で学会の開催及び運営の困難さを招いています。この学会もこの例外ではありませんでした。当初の予想どおり企業からの寄付は非常に厳しいものでしたが、幸いにも私の恩師であります順天堂大学アトピーリサーチセンター長の奥村康教授、私の順天堂大学時代からの友人であります脳神経内科学教授の服部信孝先生のお声かけで、なんとか学会を開催するための寄付が集まり学術集会を無事開催することができました。心からお礼を申し上げます。
　今回の学会で目指したのはなるべく多くの方にポスター発表をしてもらい、かつ質の高い面白いシンポジウムを企画することでした。シンポジウムの座長として東京大学の一條秀憲先生、東京医科歯科大学の清水重臣先生、東京薬科大学の田中正人先生、京都大学の鈴木淳先生、高橋良輔先生、椛島健治先生らに素晴らしい企画をしていただきました。またFasの発見者で日本の細胞死研究の草分けであります京都大学の米原伸先生、哺乳類細胞のカスパーゼの最初の発見者であり日本の細胞死研究を牽引されている東京大学の三浦正幸先生に特別講演を賜りました。私事で恐縮ですが、今回シンポジストで発表していただいた方々の一部の方は、岡田泰伸先生が世話人になり1990年代の後半〜2010年まで岡崎生理学研究所で毎年１回行われた「細胞死研究会」にコアメンバーとして参加されていた人たちです。私もその研究会の末席に参加させていただき、毎年胃が痛くなるようなプレッシャーの中で発表するという貴重な体験をさせていただきました。現在ではそのような会を開催することができなくなってしまい、非常に残念でなりません。今後はこの日本Cell Death学会をハブとして、そのような会にすることができればと思っております。
　また今回は新しい企画として若手研究者をいかに海外に派遣して、活躍してもらうかについてのパネルデイスカッションを企画しました。昨年ドイツのケルン大学教授のManolis Pasparakis博士が私のラボを訪問し、セミナ−をしてくれた時に、ドイツではpromotionするためには外国に留学することが非常に重要だというような話をされていました。一方で、現在の日本では科学研究を取り巻く環境の悪化に伴い、海外に留学する若手研究者の減少や、外国のラボとの共同研究数が減少していることが問題になっております。これについては文部科学省も色々なグラントを新規に設けて、海外への若手研究者の派遣や海外との共同研究を促進しようと模索している状況です。今回のパネルデイスカッションでは、海外でポスドクとして研究をすることの素晴らしさなどを紹介していただきました。しかし、一方で海外からなかなか日本に帰国するときに魅力的なポストを日本の大学を含めた研究機関が十分に提供できていないのではないかという問題については、十分な議論ができなかったように思います。おそらく最も問題な点は、海外で仕事がうまくいかずに論文が出なかったポスドクに対して、日本の企業や大学などがポストを提供できるようなバックアップシステムを構築できていない点ではないかと思っております。研究の世界には当然競争の原理は必要ですが、敗者復活戦のような社会環境を構築しておく必要があると思われます。今後この点については、文部科学省、大学、企業や様々な学会を含めて十分検討していく必要があると感じております。
　最後になりますが、今回の学会は参加していただいた研究者の皆様、ご寄付をいただいた企業の皆様、また裏方として頑張ってくれた東邦大学医学部生化学講座のスタッフメンバー全員のおかげで無事終了することができました。最後に深謝したいと思います。また太田先生におきましては、貴重な経験をさせていただき有難うございました。

1. はじめに

制御された細胞死としてネクロプトーシスへと至る大筋の分子メカニズムが明らかにされ、ネクロプトーシスとアポトーシスとの相互の関連も含めて多くの謎が解明されつつある。本稿では簡単にネクロプトーシス経路を説明し、さらに現時点でのネクロプトーシスに関して未解決の点について議論したい。

2. ネクロプトーシス誘導経路

ネクロプトーシスの本来の定義は、セリンスレオニンキナーゼであるReceptor-interacting protein kinase (RIPK)1キナーゼの阻害剤であるNecrostatin (Nec)-1により阻害されるネクローシス様の細胞死である1。しかし、現実的にはRIPK1の下流に存在し、ネクロプトーシス誘導に関与するRIPK3やMLKL（詳細は以下を参照）に依存する細胞死（時にはRIPK1非依存性の場合もあるが）を総称して、ネクロプトーシスということも多い。TNFαが受容体に会合しても多くの細胞では細胞死が誘導されない。この場合には複合体Iと呼ばれる転写因子NF-κBを活性化する複合体が細胞膜上で形成される。複合体Iの形成には直鎖型ユビキチン鎖やK63型ユビキチン鎖などにより様々なアダプター分子、キナーゼ分子、ユビキチン化酵素などが会合してくるが、詳細はNF-κB活性化の総説を参照されたい。一方でタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド存在下でTNFαの刺激を加えた場合には、詳細は不明だが（おそらくcFLIPの発現が低下した結果）、TRADD/FADD/Caspase 8からなる複合体IIaが形成される2,3（図1）。一方で、IAP阻害剤(BV6など)やNF-κBの活性化が抑制された状況では、RIPK1/RIPK3/FADD/Caspase 8からなる複合体IIbが形成される。複合体IIaや複合体IIbが存在する状況で、さらにzVAD-fmkやcFLIPsなどのカスパーゼ8が阻害されると、RIPK1/RIPK3/MLKLと呼ばれるネクロソームが形成され、その結果ネクロプトーシスが誘導されることが明らかにされている。複合体IIaと複合体IIbにより誘導されるアポトーシスの質的な相違は、複合体IIbはRIPK1のキナーゼ阻害剤であるNec-1で阻害できるが、複合体IIaはNec-1によって阻害されないことである。両複合体ともにカスパーゼ阻害剤であるzVAD-fmk処理により、RIPK3の発現している細胞では、アポトーシスは抑制されるものの、ネクロプトーシスが誘導されることになる。例えばRIPK3の発現していないHeLa細胞ではTNFα + CHX刺激、あるいはTNFα + BV6刺激による細胞死は、zVAD-fmkで完全に抑制される。しかし、RIPK3の発現しているHT29細胞ではいずれの刺激においてもzVAD-fmkを投与すると、ネクロプトーシスが誘導され、Nec-1を同時に投与することで、完全に細胞死が抑制される。この現象は、in vivoにおいてどのような状況で複合体IIaが形成され、あるいは複合体IIbが形成されるかについての結論は出ていないが、アポトーシス阻害剤を投与する上での副作用を考慮する点で非常に重要である。
　一般的にアポトーシス経路はネクロプトーシス経路を阻害すると考えられ、ネクロプトーシスの誘導にはカスパーゼ阻害剤を併用することが多い。この理由としてはCaspase 8と細胞死抑制因子であるlong formのcFLIPがヘテロダイマーを形成することで、ネクロプトーシス誘導に必須の分子であるRIPK1, RIPK3やRIPK1を脱ユビキチン化する酵素であるCylindromatosis (CYLD)の機能を切断することで、不活性化するのではないかと考えられている2。

3. ネクロプトーシス　ー現状と今後解明すべき問題点についてー

参考文献

• 図1. TNFαにより誘導される細胞死誘導経路。 多くの細胞ではTNFαは細胞死を誘導せず、NF-κBの活性化に関与する複合体Iを誘導する。TNFα刺激はシクロヘキシミド存在化では複合体IIaを誘導し、IAP阻害剤やNF-κBの活性化の障害された細胞では複合体IIbを誘導する。複合体IIaやIIbがzVAD-fmkやcFLIPsなどの存在化ではネクロソームが形成される。複合体IIaやIIbはアポトーシスを誘導し、ネクロソームはネクロプトーシスを誘導する。